LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNFα表达.docx

1、LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF表达LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF表达【摘要】 目的：研究脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤机制。方法：实验分为正常对照组、模型组及抗体组；正常对照组小鼠腹腔腔内注射等量0.9%NaCl。模型组腹腔内注射LPS（4 mg/kg）。抗体组在造模前810 h，应用小鼠Toll样受体4/髓样分化蛋白2（TLR4/MD2）复合物抗体腹腔内注射50 g。各组均在造模5 h后留取血和肺组织，采用细菌内毒动态浊度法检测血浆LPS的含量，HE染色判定小鼠肺组织病理变化，RT-PCR测定小鼠肺组织TLR4基因表达，Western-blot测定TLR4蛋白表达；

2、ELISA检测小鼠血清中TNF-的水平。结果：和正常对照组比较，模型组及抗体组小鼠血浆内毒素含量显著升高（P0.05），模型组小鼠肺组织HE染色呈ALI表现；和模型组比较，抗体组TLR4 mRNA、蛋白及TNF-的表达明显下调（P0.05）。结论：急性肺损伤机制可能与LPS和TLR4受体结合介导TNF-信号途径相关。 【关键词】 脂多糖； 急性肺损伤； Toll样受体4； 肿瘤坏死因子- Expression of Toll Like Receptor 4 and TNF- on Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide in Mice/G

3、U Zhi-long，JIANG Hua-mao，HU Zhan-sheng./Medical Innovation of China，2015，12（24）：016-019 【Abstract】 Objective：To study mechanism of acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice.Method：The mice were randomly divided into normal control group， model group and antibody group.Control group was

4、 given 0.9%NaCl. Model group of acute lung injury was induced by LPS at a dose of 4 mg/kg. Aitibody group mice were given anti-TLR4/MD antibody（50 g） before 8-10 h of building model group. Blood and lung tissue were taken after modeling in 4 hours. A mount of endotoxin in plasma was measured by kine

5、tic turbidimetric assay.Degree of lung damage was grated by HE staining. Expressions of TLR4 at both mRNA and protein levels were measured by RT-PCR and Western Blot.Content of TNF- in mice serum was detected by ELISA.Result：Compared with the control group，endotoxin in serum，in model group and ayibo

6、dy group significantly increased（P0.05），with obvious ALI lung damages in model group.Compared with the model group， antibody group presented that expression of TLR4 mRNA and protein lower regulated（P0.05） and ELISA results of TNF- significantly decreased（P0.05）.Conclusion：The mechanism of acute lung

7、 injury induced by lipopolysaccharide may be related to TLR4 signal passway that mediates the TNF- level. 【Key words】 Lipopolysaccharide； ALI； Toll like receptor 4； TNF- First-authors address：The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China doi：10.3969/j.issn.1674-4985.

8、2015.24.006 急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI）是在创伤、重症感染、休克等等非心源性疾病过程中，肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞损伤造成的弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭1；脂多糖（LPS）诱导的ALI在重症感染后早期出现2，并且死亡率较高3。Toll like receptors（TLRs）家族和先天性免疫系统关系比较密切4，其中TLR4目前研究最多，是LPS受体5。本实验基于建造小鼠内毒诱导ALI6-7，深入探讨ALI、LPS和TLR4及TNF-之间的关系及损伤机制，并可能为临床ALI的预防和治疗提供实验基础和新方法。 1 材料与方

9、法 1.1 主要材料、仪器及试剂 DNA marker（大连宝生物）和引物（大连宝生物），梯度PCR仪器（德国Biometre公司），超净工作台（苏州净化设备厂），DU800核算蛋白分析仪（德国BECKMAN COULTER公司），半干式转膜仪，辣根标记羊抗兔二抗（北京中杉金桥）兔抗小鼠TLR4抗体（SANTA），DNA及蛋白maker（大连宝生物），引物（大连宝生物）。 1.2 方法 1.2.1 实验动物及分组 SPF级别的BALB/C雄性小鼠，体重3035 g，随机分成3组，每组10只，A组为正常对照组，不作任何处理；B组为急性肺损伤模型组：腹腔内注射给予LPS（4 mg/kg）腹腔内注射

10、制备ALI模型；C组为抗体组：建造ALI模型前810 h给予TLR4/MD腹腔内注射（50 g）。在建造模型成功后各组小鼠无菌条件下取出肺组织和取小鼠血检测内毒素及TNF-水平，一部分肺组织置于液氮冷冻后，在-80 冰箱保存，为mRNA及蛋白表达的检测，另外部分放置在4%多聚甲醛内固定24 h后，HE染色镜下观察小鼠肺组织形态改变。 1.2.2 实验指标检测及试验方法 1.2.2.1 小鼠血内毒素含量检测 选用试剂盒（动态浊度法-血浆内毒素检测试剂）的处理方法和步骤，处理血标本，并应用LPS监测分析得出检测数据。 1.2.2.2 小鼠肺组织HE染色及形态改变 4%多聚甲醛中固定，浸润、经过梯度

11、脱水，透明化处理（二甲醛），石蜡包埋处理，各组切片6张，厚度约7 m，HE染色后，光学显微镜下观察形态及病理变化；损害评分标准应用Gloor等8方法。 1.2.2.3 小鼠肺组织TLR4基因表达 按照TAKALA说明书进行提取总RNA。TLR4基因表达：通过分光光度仪测RNA280 nm/260 nmOD值，立即开始进行逆转录，合成cDNA，引物序列（TLR4），上游5-CCCTGAAAGGCTTGGTCT-3；下游3-GAGGTGTCHHTHHTCTAA-5，扩增产物长度268 bp；引物序列（-actin），上游5-AGGCATACAGGGACAGCA-3；下游3-TACAGCAGGGTC

12、AACCATTG-5， 扩增产物长度534 bp。 反应体系：10RT Buffer 1 L，MgCl2 2 L，AMV逆转录酶 0.5 L，RNase Inhibitor 0.25 L，Oligo dT 0.5 L，RNase FREE dH2O 3.75 L，dNTP Mixture 1 L，Total RNA 1 L。反应条件：32 9 min，49.2 32 min，97 4 min，4 4 min。 cDNA为模板PCR扩增，反应体系：5PCR Buffer 10 L，MgCl2 2 L，dNTP Mixture 1 L，cDNA 2 L，上下游引物各1 L，H2O 32.75 L，

13、Taq酶 0.25 L；反应条件：96 6 min、（95 30 s、49.2 30 s、72 30 s）33 cycle、72 9 min。 1.2.2.4 小鼠肺组织TLR4蛋白表达 取小鼠肺组织进行总蛋白的提取，提取后用BCA法进行蛋白含量的检测，检测后进行PAGE凝胶电泳，电泳分离60 min后，通过maker条带选取约95 kd大小切胶，应用半干转膜方法，封闭60 min，经过一抗、二抗孵育，ECL显色，暗室内曝光，Tannon Gis软件分析测曝光底片光密度值。 1.2.2.5 小鼠血浆TNF-双抗夹心ELISA检测 通过应用ELISA检测TNF-试剂盒方法与流程进行标本处理及检测

14、，并在酶标仪进行检测分析。 1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以（xs）表示，各组的均数采取单因素方差分析，组间进行两两比较LSD检验，P0.05为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 建模小鼠情况 各组小鼠观察情况如下：A组无死亡小鼠，B组小鼠攻毒后最初仅异常活动增多，随后出现蜷缩、抱团现象，刺激无反应，不能进食、水，腹部呼吸频率快，死亡1只；C组小鼠变化同A组。 2.2 LPS含量检测 和A组比较，B组（模型组）LPS水平显著升高，C组LPS水平也呈现升高趋势，建模成功，见表1、图1。 表1 各组小鼠血浆内毒素水平 组别 只数（只） LPS水平（EU/

15、mL） A组 10 60.89 B组 9 123010.38* C组 10 100312.49* *与A组比较，P0.05 图1 各组小鼠血浆内毒素水平 2.3 小鼠肺组织HE染色镜下观察 小鼠攻毒造模后，镜下肺泡水肿及腔内红染，肺泡间隔增厚并充血，视野可见大量中性粒细胞浸润。抗体组干预后小鼠肺组织状况明显改善，镜下仅少量中性粒细胞浸润，肺泡及间隔水肿不明显，见表2、图2、图3。 表2 各组小鼠肺组织病理学评分 组别 只数（只） 组织病理学评分（分） A组 10 1.000.68 B组 9 8.030.89* C组 10 2.750.65# *与A组比较，P0.05；#与B组比较，P0.05

16、图2 各组小鼠肺组织HE染色镜下改变（200） 图3 各组小鼠肺组织病理学评分 2.4 各组小鼠TLR4基因的表达 A组小鼠（正常对照组）肺组织内仅有少量TLR4 mRNA表达。与A组比较，B组（模型组）TLR4 mRNA表达明显上调（P0.05），C组（抗体组）和B组比较，TLR4 mRNA表达呈下调（P0.05），见表3、图4、图5。 表3 各组小鼠TLR4 mRNA及Protein表达 组别 只数（只） TLR/-actin（mRNA） A组 10 0.25760.0447 B组 9 0.98460.0675* C组 10 0.30180.0847# *与A组比较，P0.05；#与B组比

17、较，P0.05 图4 TLR4 mRNA表达 图5 TLR4 mRNA及Protein表达结果 2.5 各组小鼠TLR4蛋白的表达 A组小鼠（正常对照组）肺组织内仅有少量TLR4 Protein表达。与A组比较，B组（模型组）TLR4 Protein表达明显上调（P0.05），C组（抗体组）和B组比较，TLR4 Protein表达呈下调（P0.05），见表4、图5、图6。 表4 各组小鼠TLR4 Protein表达 组别 只数（只） TLR4/-actin（Protein） A组 10 0.21680.0473 B组 9 0.88140.0687* C组 10 0.30460.0689# *与

18、A组比较，P0.05；#与B组比较，P0.05 图6 TLR4 Protein表达 2.6 各组小鼠TNF-检测 TNF-水平变化同TLR4 mRNA和Protein趋势相同。C组（抗体组）的TNF-水平明显低于B组（模型组），差异有统计学意义（P0.05），见表5、图7。 表5 各组小鼠TNF-表达（xs） 组别 只数（只） TNF-（pg/mL） A组 10 287.682.96 B组 9 986.5610.65* C组 10 320.4611.84# *与A组比较，P0.05；#与B组比较，P0.05 图7 TNF-表达 3 讨论 ALI/ARDS病死率极高，其致病原因主张分直接肺损伤和

19、间接肺损伤9。直接肺损伤因素：误吸，重症肺炎，肺挫伤，再灌注及淹溺等；间接肺损伤因素：严重创伤伴休克，脓毒症及大量输血制品等10。LPS水平在导致ALI病死率高达70%90%11-12，以往研究认为，炎症调控的强弱是NF-kB，其受LPS、缺氧、创伤等多种因素启动13-14，诱导多种细胞因子（如IL1、IL4、IL6、IL8、PAF）、黏附分子急性期反应蛋白等进行下游表达，从而产生一系列的SIRS生物学效应。TLR4是先天性免疫系统识别病原微生物主要受体，为LPS主要受体15。近年，对于TLRs家族成员与疾病的关系研究愈发收到关注、尤其是TLR416。 本实验动物模型制备简单，可控性腔，重复率

20、较高，同人类急性肺损伤相似。和正常对照组比较，模型组TLR4 mRNA、Protein及TNF-表达明显上调，提示ALI发生机制可能和TLR4及TNF-相关。和模型组比较，抗体组的TLR4介导LPS信号通路表达下调，从而使炎性介质、细胞因子等减少，TNF-水平下调，丧失了对LPS的反应性，进而产生耐受，故通过阻断TLR4信号靶点的表达，降低其下游TNF-水平，能够增加LPS耐受性的产生和LPS导致的ALI。既往研究热点主要是NF-kB、NO、IL1、黏附因子等下游分子的启动，而本实验从LPS受体蛋白TLR4作为研究靶点，实验表明TLR4是控制ALI的瀑链式SIRS的门户蛋白。 综上所述，脓毒血

21、症导致ALI，通过腹腔内注射LPS动物模型复制性较好；其损伤机制可能是LPS和TLR4受体结合，介导TNF-信号途径导致。通过干预TLR4受体靶点能够下调TNF-，减轻临床症状，这位临床对于脓毒血症所致ALI提供新的治疗思路和实验基础。 参考文献 1 Bakowitz M， Bruns B， McCunn M. Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome in the injured patientJ. Scand J Trauma Resusc Emerg Med， 2012， 20（1）：54. 2王建红，李红

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