WB实验问题.docx

1、WB实验问题Western Blot问题指南时间:2011-05-13 08:55来源:网络 作者:admin 点击:3679次根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）; 1. 参考书推荐 A. 对初学者看什么资料比较好 解答：抗体技术实验指南和Antibodies（a laboratory manual，根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）;1. 参考书推荐A. 对初学者看什么资料比较好解答：抗体技术实验指南和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两

2、本书不错。2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120g，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。C. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗

3、解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。D. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。E 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加510甲醇。F. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适积层胶的浓度又该用多少这么大分子量的蛋白容易作Western

4、Blot吗解答：260kd的蛋白不好做， 分离胶用6， Stacking Gel 。G. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试的 comb。H. 蛋白变性后可以存放多久解答：80，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。I. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11的配方，不知为

5、何解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。J. 接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5的脱脂奶粉呢好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替应该好一点K. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗解答：Western Blot一般上样30100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始

6、摸条件时，为了拿到阳 性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适 合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。L. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗还有，您用过大牛血清做封闭剂吗浓度如何效果是不是比BSA好一点解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更 好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活 性（加入PMSF和蛋白酶抑制剂 cockta

7、il），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用BSA也是不错的选择。M. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。N. 有什么方法可以提高上样量解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。O. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大解答：如是需要提取膜蛋白，

8、（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。P. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求解答：上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等， 如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超过g/mm2。Q. 一抗，二抗的比例是否重要解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。3. 抗体R. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Wester

9、n Blot，其二抗有何要求解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。S. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀 释度也是不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间，还要看 你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短 West

10、ern Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗 1：1500；二抗1：20000试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这 样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！T. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇 （又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后 变性会消失。

11、如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形 表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）U. Western Blot 中抗体的重复应用问题解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用23次。稀释后应在23天内使用，4度保存，避免反复冻融。4. 滤纸、胶和膜的问题V. NC膜 PVDF膜 尼龙膜怎样鉴别解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。就结

12、合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480600g/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80100g/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125300g/cm2。就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素

13、膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。W. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。X. 检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗解答：可以。AA. 转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液解答：用上样

14、缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。CC. 采用tank system有什么讲究解答：建议低电压，长时间，（一般tank System 用衡压好点），如 28V 1416hrs。DD. 做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHC。EE. 膜一般要如何处理解答：一般用甲醇泡泡就可以了。 FF. 如果是68转印膜，要加多少一抗解答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为35ml。GG. 上下槽缓冲液有何要求，怎样

15、才能达到最佳效果。解答：无要求。HH. 跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢是有的成分不对吗解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿 保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制 一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极滤纸胶膜滤纸。滤纸的长宽分别比胶小12mm，而膜的长宽分别比胶大12mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电

16、流不会通过胶和滤纸。JJ. 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12SDS-PAge， 湿转36V ， 35hrs就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDSpage， 48V 10hrs16hrs。KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓 度）(优化的转移缓冲液，可以参考蛋白质技术手册)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇

17、 对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（微米）；使 用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压电流；增加转移时间。LL. 如何选择最合适的蛋白杂交膜解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。硝酸纤维素膜： 硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下

18、，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一 起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合 的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是 膜孔径如果小于，蛋白的转移就很难进行了。因此，我们通常用m和m两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用 m的膜，小于20kD的蛋白就要用m的膜了，如果用m的膜就会发生“Blowthrogh”的现象。从膜的质地上来看，最 重要

19、的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维 素，因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150g/cm2。由于 100%的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜 比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。PVDF转移膜：PVDF 是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它

20、用于蛋白质的序列测定，因为硝酸 纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然 PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进 行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于低分子量蛋白的检 测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。离子交换型转移膜： 硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修饰

21、的纤维素制成的 DEAE阴离子交换膜同样可以作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下，DEAE 基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种 m孔径的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，还可以用于核酸结合研究。还有一种离子交换型膜是羧甲基（CM）修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序。5. M

22、arker的相关疑问MM. 我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因怎样改善胶用过8，10，12，都是这样。marker是新买的。解答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。前几次做 West

23、ern Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时 在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。但就是出不来结果， 我很茫然。谢谢您过给予指点！解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。”有的时候，Prest

24、ained Marker 放久了效果就会变差，电泳是条带不清晰，扩散。但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多加点甲醇。2、“前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好。3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位 的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。”是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性对照你要做这么大的蛋

25、白最好转移时间延长到。6. 染色的选择OO. Western Blot哪种染色好解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色 快，背景低检测极限可达到 g，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系 统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。7. 参照的疑问PP. 是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参解答：对于发表文章的实验最好加内参

26、，实验严谨。QQ. 用BANDSCAN分析结果行吗解答：分析一般的结果没问题。RR. 核内抗原Western Blot内参选择什么合适解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。SS. 转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据cm2，一般1小时左右解答：不是的， 半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。TT. 做半定量人卵巢癌细胞系的Western Blot，内参B-actin，GAPDH，那个好解答：选用beta-actin就可以。8. 缓冲液配方的常见问题UU. 转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么还

27、有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。TrisHCl就是Tris盐用HCl调ph值，配置而成。VV. 准备做大鼠脑子的Western Blot，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是每一步都必须要低温吗这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生解答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。WW. 想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗受不受组织来源的影响胞膜和胞浆有区别吗解答：一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊

28、的方法，一般来说都没有区别。XX. 最近作了两次Western Blot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD-分子量67kd， 提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把样本-20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是 1:100。如果是一抗的原因，不会背景都没有把3、第一次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱 脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为 %，不会是封闭液的问题吧解答：可以在下面几个问题上找找原因

29、。1. 封闭液用5Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有问题。YY. 加甲醇的目的是什么解答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。ZZ. “转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大解答：是Tween，配方如下:Tris- Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve of NaCl， of KCl， and 3g of Tris base

30、in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.AAA. 封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如现在我就在室温里做，或者要在4度下解答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。BBB. 实验室暂无NP40我用sds可以吗另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 ，新鲜加入：65mM DTT蛋白酶抑

31、制剂：试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行改 良的RIPA裂解缓冲液， 50 mmol/L， pH ; NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%; 脱氧胆酸钠， %; SDS， %; EDTA， 1 mmol/L; PMSF， 1 mmol/L; Leupeptin， 2 g/ml)不知对于膜蛋白效果如何此外该方中的EDTA， 是否用做蛋白酶抑制剂解答：做2-D对不推荐使用NP-40（因为即使进口的 NP-40也不纯，其中的杂质会影

32、响质谱结果）。对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail，因为7M尿 素+2M硫脲+4%CHAPS构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白酶的活性，2M硫脲+4%CHAPS对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过如果您专职做膜 蛋白建议采用分级抽提法。此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。EDTA用于灭活金属蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加过多的蛋白酶抑制剂可以 导致蛋白质的修饰，做WB无所谓，做MAILDI时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质(在2-D裂解缓冲液中，两性电解质起的作用：提供 连续的PH梯度，从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一部分核酸)；也不推荐采用SDS，因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生改变，如果您实 在要用，终浓度降到%以下。METHOD2（50ml