复合酶协同超声提取藜麦皂苷及其抗氧化性.docx

1、复合酶协同超声提取藜麦皂苷及其抗氧化性复合酶协同超声提取藜麦皂苷及其抗氧化性 复合酶协同超声提取藜麦皂苷及其抗氧化性 复合酶协同超声提取藜麦皂苷及其抗氧化性 雷 蕾收稿日期：2018-06-22；定用日期：2018-00-00；DOI： 基金项目：青海省基础研究计划项目（2017-ZJ-712）。 作者简介：雷蕾（1994），女，硕士生， E-mail：1257502773。 *联系人：张炜（1972），女，教授，E-mail：zhangwei。 ，张 炜*，刘 龙，于小栋，辛小丽，田格 （青海师范大学 化学化工学院，青海 西宁 810008） 摘要：采用复合酶协同超声提取藜麦种皮皂苷，并对其

2、抗氧化活性进行了测定。 以藜麦皂苷的提取率为指标，考察了酶配比m（纤维素酶）：m（果胶酶）、酶用量、酶解温度、pH、酶解时间对藜麦皂苷提取率的影响，并用响应面法进行了优化。 得到最佳工艺条件为：总酶用量(以藜麦种皮质量为基准，下同)为1.5%，酶配比m（纤维素酶）：m（果胶酶）为32，酶解温度为50.5，pH为5.5，酶解时间为0.25 h；在该条件下，藜麦皂苷的提取率较高，达到85.32%；该法对藜麦种皮皂苷的提取率比单一纤维素酶提取率(81.56%)高4.41%，比单一果胶酶提取率(82.20%)高3.66%，比单独超声提取率高16.76%。 采用清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(

3、DPPH)的能力，分析藜麦皂苷的抗氧化活性，结果表明，藜麦皂苷具有显著的抗氧化活性，且与皂苷的质量浓度呈剂量依赖性。 关键词：藜麦种皮；皂苷；复合酶；超声；响应面法；抗氧化活性；中药现代化技术 中图分类号: O629.9 文献标识码: A 文章编号: Complex Enzyme Assisted Ultrasonic Extraction of Saponins from Quinoa Husk and Its Antioxidant Activity LEI Lei, ZHANG Wei*, LIU Long, YU Xiao-dong, XIN Xiao-li, TIAN Ge (Sch

4、ool of Chemistry and Chemical Engineering, Qinghai Normal University, Xining 810008, Qinghai, China) Abstract: Saponins were extracted from quinoa husk using complex enzyme assisted ultrasonic technology and its antioxidant activity was measured. The effects of enzyme ratio (mass ratio of cellulase

5、to pectinase), enzyme dosage, enzyme hydrolysis temperature, pH value and enzyme hydrolysis time on the extraction yield of quinoa saponins by single factor experiment. On the basis of the single factor experiment, response surface methodology was used to optimize the technical parameters, and the o

6、ptimum parameters were as follows: total enzyme dosage (based on the mass of quinoa husk, the same below) 1.5%, enzyme ratio (mass ratio of cellulase to pectinase 3:2), enzyme hydrolysis temperature 50.5, pH=5.5, and enzyme hydrolysis time 0.25 h. Under these optimum conditions, the extraction yield

7、 of quinoa saponins reached a maximum of 85.32%, which was 4.41% higher than that using only cellulase (81.56%), 3.66% higher than that using only pectinase (82.20%), and 16.76% higher than that using only ultrasonic extraction. The antioxidant activity of the extracted saponins was evaluated by DPP

8、H. The results showed that the saponins extracted from quinoa husk had significan antioxidant activitiy, and saponins concentration and antioxidant activity was in a dose- dependent manner. Key words: quinoa husk; saponins; complex enzyme; ultrasonic; response surface methodology; antioxidant activi

9、ty; modernization technology of traditional Chinese medicines Foundation item: Basic Research Project of Qinghai Province (2017-ZJ-712) 藜麦(Chenopodium quinoa Willd L.)又称南美藜、藜谷等，属藜科，是起源于南美洲安第斯山脉地区的双子叶植物1-4，富含维生素、微量元素（如矿物质钾，铁，钙等）、膳食纤维、蛋白质及必需氨基酸 5-7，同时含有皂苷、多酚类、黄酮类、植物甾醇等生物活性成分，具有抗真菌，抗病毒，抗癌，降胆固醇，降血糖，抗血栓，

10、利尿，抗炎等多种功效8-10，被称为“粮食之母”，被定义为“21世纪的粮食之一”11-12。 虽然藜麦引种已遍布全球，成为食品领域的研究热点，但中国对藜麦的研究仍处于育种、种植和初加工阶段，对藜麦营养价值、活性物质及其应用的研究较少13-15。 藜麦种皮中含有丰富的皂苷，是天然皂苷的重要来源，质量分数为0.14%2.30%16，主要存在于种皮中，占总皂苷的68%17。 提取皂苷的方法主要为有机溶剂提取法、酸水解法、超临界流体二氧化碳法和超声提取法18-20，但单一的提取方法存在提取率低、提取时间长、样品回收率差等缺点21-24。 生物酶可以水解蛋白质、纤维素、果胶等，具有操作时间短，成本低，作

11、用条件温和等优点，被逐渐应用于天然产物的提取中。 超声提取法通过超声空化，机械作用和热效应来加速细胞内活性物质的释放，扩散和溶解。 为此，在超声提取前加入酶解工艺，以提高皂苷的提取率。 但由于酶特异性强，作用范围较小，细胞壁破除率不高，皂苷的提取率（果胶酶82.20%；纤维素酶81.56%）较低。 考虑到藜麦种皮中含有大量的纤维素以及果胶质等，因此，采用纤维素酶和果胶酶复合酶制剂，改变细胞壁的通透性，以提高皂苷的提取率25。 本文以藜麦种皮为研究对象，采用复合酶辅助超声波法提取皂苷，综合了生物酶法以及超声波提取法的优点，并以对DPPH的清除率为指标，考察了藜麦皂苷的体外抗氧化活性，实现了资源的

12、再利用和可持续发展，为藜麦种皮皂苷的进一步开发利用提供了理论依据。 1 实验部分 1.1 材料、试剂与仪器 藜麦种皮，选购于青海三江沃土生态农业科技有限公司（经青海省食品药品检定所姜世贤研究员鉴定）；纤维素酶(50000 U/g)、果胶酶(100000 U/g)，宁夏和氏璧生物技术有限公司；齐墩果酸标准品、DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），上海源叶生物科技有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙醇和盐酸，AR，国药集团化学试剂有限公司。 TU-1901 双光束紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。 1.2 方法 1.2.1 香草醛-冰醋酸溶液的配制 准确称取5 g香草醛，用

13、冰醋酸溶解并定容至100 mL，摇匀，制得50 g/L的香草醛-冰醋酸溶液，备用。 1.2.2齐墩果酸标准曲线的绘制15 由于藜麦种皮皂苷主要为齐墩果酸型的三萜皂苷，选择齐墩果酸作标准品，用香草醛-高氯酸比色法进行皂苷浓度测定13,26。 其反应原理为：皂苷在强氧化性酸作用下发生脱氢，被氧化，与香草醛结合，生成一种紫色络合物。 准确称取齐墩果酸标准品25 mg，加少量乙醇溶解后，定容于25 mL容量瓶中，摇匀，制成1 g/L齐墩果酸标准溶液；用移液枪准确移取10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 L于10支10 mL试管中，70水浴，挥发除去溶剂；加入50 g/L香草醛-

14、冰醋酸溶液0.2 mL, 高氯酸0.8 mL，摇匀；60水浴加热15 min，取出后立即用冰水浴冷却5 min；加入4 mL乙酸乙酯，以不加标准品溶液的样品作空白，在400800 nm处进行紫外扫描，测得该样品在550.00 nm处有最大吸收。 以标准物质量浓度和吸光度关系作线性回归，得标准曲线方程为 A=0.04904-0.01141，R2=0.9994。 1.2.3 藜麦种皮的预处理 将藜麦种皮样品过80目筛，在50的烘箱中，干燥至恒重，备用。 1.2.4 藜麦种皮的酶解以及皂苷的提取 准确称取2 g藜麦种皮粉于250 mL圆底烧瓶中，加入30 mL去离子水和酶制剂（总酶用量为1.5%，以

15、藜麦种皮粉质量为基准，下同）m（纤维素酶）：m（果胶酶）=32，调节体系pH为5.0，电磁搅拌在50下酶解0.5 h；待酶解完成后，90下30s 灭酶28-29；加入70 mL无水乙醇，超声提取20min。 将提取液减压过滤，滤渣重复提取1次(50 mL体积分数为70%的乙醇溶液)，合并滤液。 提取过程重复5次。 采用分光光度法测定藜麦种皮皂苷浓度，并按下式计算皂苷提取率 (1) 式中：m1为皂苷提取量（mg）；m0为总皂苷量(mg)，即根据响应面实验得出的最佳提取工艺进行多次提取，并将其多次提取量进行加和。 1.2.5 藜麦皂苷的抗氧化性实验 将样品母液分别稀释为200、400、600、80

16、0、1000、1200、1400、1600、1800、2000 mg/L。 采用参考文献27方法进行测定，并用下式计算清除率。 (2) 式中：A0为空白对照实验测定的吸光度，即未加样品的DPPH自由基吸光度（DPPH自由基溶液+溶剂）；A1为样品组测定的吸光度，即加入样品反应平衡后的吸光度（DPPH自由基溶液+样品溶液）；A2为干扰组测定的吸光度，即样品本身的吸光度（样品溶液+溶剂）。 2 结果与讨论 2.1 单因素实验 2.1.1 纤维素酶用量对藜麦皂苷提取率的影响 准确称取2 g藜麦种皮粉，控制酶解温度为45，调节体系pH为5.0，酶解时间为0.5 h, 选取纤维素酶用量(以藜麦种皮质量为

17、基准，下同)分别为0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，实验方法同1.2.4节。 以提取率为评价指标，考察了纤维素酶用量对提取率的影响，结果如图1所示。 图1 纤维素酶用量对提取率的影响 Fig. 1 Effect of dosage of cellulase on the extraction yield 如图1所示，加酶量为01%时，藜麦皂苷提取率随加酶量的增加而上升。 可能是因为酶用量较低时，酶能够全部参加反应，上升速度较快，在加酶量达到1.0%时，提取率达到最大值，为81.56%；但加酶量高于1.0%时，提取率下降。 可能是由于过多的酶使浸提液的黏稠度增加，阻碍了皂苷的

18、游离扩散，不利于分离提取30-31。 因此，选取最佳纤维素酶用量为1.0%。 2.1.2 果胶酶用量对藜麦种皮皂苷提取率的影响 准确称取2 g藜麦种皮，控制酶解温度为50，调节体系pH为5.0，酶解时间为1.0 h,实验方法同1.2.4节。 考察了果胶酶用量(以藜麦种皮质量为基准，下同)对提取率的影响，结果如图2所示。 图2 果胶酶用量对提取率的影响 Fig. 2 Effect of dosage of pectinase on the extraction yield 如图2所示，随着果胶酶用量的增加，皂苷提取率不断增加，说明酶催化反应速度与酶浓度呈正相关性，尤其果胶酶用量在1.0%以下时，

19、增加较为明显；酶用量在1.5%时，达到最大值，为82.2%。 从节约的角度考虑，选取最佳果胶酶用量为1.5%。 2.1.3酶配比m（纤维素酶）m（果胶酶）对藜麦种皮皂苷提取率的影响 基于以上纤维素酶和果胶酶单独水解藜麦种皮提取皂苷的酶用量结果，并考虑到经济成本，准确称取2 g藜麦种皮，控制总酶用量为1.0%、1.5%，酶解温度为50，调节体系pH为5.0，酶解时间为0.5 h，实验方法同1.2.4节。 考察了酶配比m（纤维素酶）：m（果胶酶）分别为01、12、23、11、32、21、10时对提取率的影响，其余步骤同上。 结果如图3所示。 图3 酶配比m（纤维素酶）m（果胶酶）对提取率的影响 F

20、ig. 3 Effect of mass ratio of cellulase to pectinase on the extraction yield 如图3所示，总酶用量为1.5%，酶配比m（纤维素酶）m（果胶酶）为32时，藜麦种皮皂苷的提取率最高。 酶配比为01（只添加果胶酶），总酶用量为1.0%的提取率比1.5%的提取率低；酶配比为10（只添加纤维素酶），总酶用量为1.0%的提取率比1.5%的提取率高；符合单酶单因素实验结果。 主要是由于藜麦种皮中含有大量的纤维素以及果胶质，添加纤维素酶以及果胶酶促进了皂苷向溶剂中的扩散。 因此，选取最佳总酶用量为1.5%， m（纤维素酶）m（果胶酶）

21、=32进行后续实验。 2.1.4 酶解温度对藜麦皂苷提取率的影响 准确称取2 g藜麦种皮粉，控制总酶用量为1.5%，酶配比m（纤维素酶）m（果胶酶）为32，调节体系pH为5.0，酶解时间为0.5 h，实验方法同1.2.4节。 考察了酶解温度对提取率的影响，结果如图4所示。 图4温度对提取率的影响 Fig. 4 Effect of temperature on the extraction yield 如图4所示，酶解温度小于50时，随酶解温度的升高，藜麦皂苷的提取率不断增加，说明酶解温度与提取率呈正相关性；当酶解温度大于50时，藜麦皂苷的提取率逐渐降低，这可能是由于温度过高，导致酶活性降低。

22、因此，选取酶解温度为50进行后续实验。 2.1.5 pH对藜麦种皮皂苷提取率的影响 准确称取2 g藜麦种皮粉，控制总酶用量为1.5%，酶配比m（纤维素酶）m（果胶酶）为32，酶解温度为50，酶解时间为0.5 h，实验方法同1.2.4节。 考察了pH对提取率的影响，结果如图5所示。 图5 pH对提取率的影响 Fig. 5 Effect of pH value on the extraction yield 如图5所示，在pH为4.05.0时，藜麦皂苷提取率逐渐上升，pH超过5.0时，藜麦皂苷提取率逐渐下降，这可能是由于pH不在酶的适用pH范围内，导致酶活性降低。 因此，选取pH值5.0进行后续实

23、验。 2.1.6酶解时间对藜麦皂苷提取率的影响 准确称取2 g藜麦种皮粉，控制总酶用量为1.5%，酶配比m（纤维素酶）m（果胶酶）为32，酶解温度为50，调节体系的pH为5.0，实验方法同1.2.4节。 考察了酶解时间对提取率的影响，结果如图6所示。 图6 酶解时间对提取率的影响 Fig. 6 Effect of enzyme hydrolysis time on the extraction yield 如图6所示，皂苷的提取率随酶解时间的延长呈现先上升后下降的趋势。 当水解时间为0.5 h时，皂苷的提取率达到最大值。 随着时间的增加，在一定范围内，可促进皂苷的溶出；但酶解时间过长导致皂苷降

24、解，使皂苷的提取率下降。 因此，为了缩短工作时间和减少能耗，选取最佳酶解时间为0.5 h 15。 2.2 Box-Behnken响应面优化实验 2.2.1水平与因素的选取 由于酶配比m（纤维素酶）m（果胶酶）对藜麦种皮皂苷提取率影响的原理和对实验结果的影响较为复杂，在较低酶用量下酶解时间较长，酶用量对提取率的影响与酶解时间一致；考虑到实验成本，选择温度，pH和时间进行响应面实验设计，以提取率为响应值，探究提取藜麦种皮皂苷的最佳工艺条件，因素与水平的选择见表1。 表1 藜麦种皮皂苷响应面因素水平设计表 Table 1 Factor and level in response surface de

25、sign 水平 因素 A 温度/ B pH C 时间/h -1 45 4.5 0.25 0 50 5.0 0.50 1 55 5.5 0.75 2.2.2 响应面实验设计和结果 选取酶解温度(A)、pH值(B)、酶解时间(C)进行三因素三水平的Box-Behnken 响应面实验设计，响应面实验设计及结果见表2。 表2 响应面实验设计及结果 Table 2 Response surface design and experimental results 序号 A 温度/ B pH C 时间/h 提取率 /% 1 45 5 0.25 77.96 2 55 5 0.75 76.87 3 50 5 0

26、.5 84.59 4 55 5 0.25 85.17 5 50 5 0.5 84.13 6 50 5 0.5 84.24 7 50 5.5 0.75 82.82 8 45 5 0.75 82.7 9 55 5.5 0.5 84.07 10 50 5 0.5 84.13 11 50 4.5 0.25 83.11 12 50 5.5 0.25 86.17 13 55 4.5 0.5 80.09 14 50 4.5 0.75 83.25 15 50 5 0.5 84.53 16 45 4.5 0.5 81.05 17 45 5.5 0.5 79.67 2.2.3 回归模型的建立与检验 对表2数据用多

27、元回归拟合后，得到藜麦种皮皂苷提取率(E)与酶解温度(A)、pH(B)、酶解时间(C)的回归方程：E=-187.659+11.2775A-23.1725B+170.167C+ 0.536AB-2.608AC-6.98BC-0.12533A2+0.117B2-8.252C2,说明单因素对响应值的影响不是简单的线性关系。 对回归方程进行方差分析，结果见表3。 表3 提取率线性回归分析表 Table 3 ANOVA for response of the extraction yield 来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性 模型 108.21 9 12.02 113.52 0.1);

28、 *, 差异显著， P pH值温度。 因此，酶解时间被认为是最重要的因素。 2.2.4 响应曲面分析及最佳工艺条件的确定 两因素交互作用见图7。 根据图7结果，使用软件Design-Expert 8.0.6为藜麦种皮皂苷提供最佳提取条件，最佳条件为：总酶量为1.5%，酶配比(纤维素酶果胶酶)为32，酶解温度为50.61，体系pH值为5.36，酶解时间为0.29 h。 在此条件下，藜麦皂苷提取率的预测值为86.1705%。 图7响应曲面3D图 Fig. 7 Response surface 3D plots for interaction 为验证预测模型的可靠性，采用响应面法预测条件进行验证实验

29、。 结合实际需求，优化条件分别为：总酶用量1.5%，酶比例m（纤维素酶）m（果胶酶）32，酶解温度50.5，pH值5.5，酶解时间0.25 h。 在上述条件下，藜麦种皮皂苷的提取率为85.32%，与预测值非常接近。 说明采用响应面法得到的拟合模型能很好地预测提取率与各实验因素之间的关系，工艺条件参数可靠，具有一定的实际应用价值。 2.3 藜麦皂苷抗氧化性实验 如图8所示，藜麦种皮中的皂苷有清除 DPPH的能力，且清除力随皂苷质量浓度增大而升高，当质量浓度小于1200 mg/L时，线性关系良好，其相关系数为0.9993，相关性显著；当质量浓度大于1200 mg/L后，清除力增长缓慢。 皂苷对DP

30、PH的清除率最高可达到85.53%，清除力良好。 图8 藜麦皂苷对DPPH清除 Fig. 8 Removal ability of total saponins toward DPPH 3 结论 本文在单因素实验的基础上，以提取率为评价指标，根据Box-behnken实验设计原理，采用响应曲面法优化藜麦种皮皂苷的提取工艺，得出最佳工艺条件：总酶用量(以藜麦种皮质量为基准)为1.5%，酶配比m（纤维素酶）m（果胶酶）为32，酶解温度为50.5，pH值为5.5，酶解时间为0.25 h；在此条件下，藜麦皂苷的提取率较高，达到85.32%；复合酶协同超声提取藜麦种皮皂苷的提取率比单一纤维素酶的提取率(

31、81.56%)高4.41%，比单一果胶酶的提取率(82.20%)高3.66%，比单独超声提取高16.76%。 结果表明，复合酶协同超声提取是一种高效，低耗能，低成本的藜麦种皮皂苷提取方法。 对藜麦皂苷活性进行分析表明，藜麦皂苷具有清除DPPH的能力，且呈现剂量效应，抗氧化能力与皂苷质量浓度相关性显著，为藜麦种皮皂苷的进一步开发利用提供了理论依据和实验参考。 参考文献 1 Li G, Zhu F. Molecular structure of quinoa starchJ. Carbohydrate Polymers, 2017, 158:124-132. 2 Vilcacundo R, Her

32、nndez-Ledesma B. Nutritional and biological value of quinoa (Chenopodium quinoa, Willd.)J.Current Opinion in Food Science, 2017, 14: 1-6. 3 Navruz-Varli S, Sanlier N. Nutritional and health benefits of quinoa (Chenopodium quinoa, Willd)J. Journal of Cereal Science, 2016, 69:371-376. 4 Li G, Zhu F. Physicochemical properties of q