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1、细胞生物学第十章细胞核与染色体课程预习第十章 细胞核与染色体 细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞器，是细胞遗传与代谢的调控中心。所有真核细胞，除高等植物韧皮部成熟的筛管和哺乳动物成熟的红细胞等极少数例外，都含有细胞核。细胞核主要由核被膜、染色质及核仁组成。 一、核被膜与核孔复合体 (一)核被膜 1结构组成 核被膜(nuclear envelope)位于间期细胞核的最外层，是细胞核与细胞质之间的界膜。它是核与质之间的天然选择性屏障，并将细胞分成核与质两大结构与功能区域。DNA复制、RNA转录与加工在核内进行，蛋白质翻译则局限在细胞质中。同时核膜在核与质问也有频繁的物质交换与信息交流，这主要是通

2、过核被膜上的核孔复合体进行的。 核被膜的结构：核被膜在电镜下可分为双层核膜、核孔复合体与核纤层。 双层核膜：面向核质的一层膜被称为内(层)核被膜(inner nuclear membrane)，面向胞质的另一层膜称为外(层)核被膜(outer nuclear membrane)，两层膜厚度均为75nm，两层膜之间有2040nm的透明空隙，称为核周间隙(perinuclear space)或核周池(perinuclear cisternae)。 主要特点： (1)外核膜表面常附有核糖体颗粒，且常常与糙面内质网相通连，使核周间隙与内质网腔彼此相通。 (2)内核膜表面光滑，无核糖体颗粒附着，但紧贴其

3、内表面有一层致密的纤维网络结构，即核纤层。内核膜上有一些特有的蛋白成分，如核纤层蛋白B受体(1amin B receptor，LBR)。 (3)内外膜之间平行，但并不连续，某些部位相互融合形成环状开口，称为核孔(nuclear pore)，在核孔上镶嵌着一种复杂的结构，称为核孔复合体(nuclear pore complex，NPC)。核孔周围的核膜特称为孔膜区(pore membrane domain)，它有一些特有的蛋白成分如核孔复合体特有的跨膜糖蛋白gp210、p62等。 核纤层(nuclear lamina)是一层紧贴于内层核膜下，由纤维蛋白构成的网络结构，它与细胞质中间纤维、核内骨架

4、有密切的关系。 2核被膜在细胞周期中的崩解与装配 在真核细胞的细胞周期中，核被膜有规律地解体与重建。在分裂期，双层核膜崩解成单层膜泡，核孔复合体解体，核纤层去装配。到分裂末期，核被膜开始围绕染色体重新形成。实验证明在核被膜重建时，旧核膜参与了新核膜的重建。大量证据表明，有一种直径200nm左右的单层小膜泡直接参与了核膜的形成。 (二)核孔复合体 核孔复合体的数量与分布，随细胞类型、细胞核的功能状态而差异很大。一般而言，转录功能活跃的细胞，其核孔复合体数量较多。一个典型的哺乳动物细胞核被膜上的核孔复合体总数约30004000个，相当于1020个m2。 1结构模型 对于这个结构模型目前有两种理解：

5、从横向上看，核孔复合体有周边像核孔中心依次可分为环、辐、栓三种结构亚单位；从纵向上看，核孔复合体由核外(胞质面)向核内(核质面)依次可分为胞质环、辐(+栓)、核质环三种结构亚单位，形成“三明治”结构。综合起来，核孔复合体主要有以下4种结构组分： 胞质环：位于核孔边缘的胞质面一侧，又称外环，环上有8条短纤维对称分布伸向胞质；核质环：位于核孔边缘的核质面一侧，又称内环，内环比外环结构复杂，环上也对称地连有8条细长纤维，向核内伸入5070nm，在纤维的末端形成一个直径为60nm的小环，小环由8个颗粒构成。这样整个核质环就像一个“捕鱼笼”样的结构，也有人称为核篮结构；辐：由核孔边缘伸向中心，呈辐射状八

6、重对称。它的结构也比较复杂，可进一步分为三个结构域：主要的区域位于核孔边缘，连接内外环，起支撑作用，称作“柱状亚单位”。在这个结构域之外，接触核膜部分的区域称为“腔内亚单位”，它穿过核膜伸入双层核膜的膜间腔。在“腔内亚单位”之内，靠近核孔复合体中心的部分称作“环带亚单位”，由8个颗粒状结构环绕形成核孔复合体核质交换的通道。 栓：或称中央栓，位于核孔的中心，呈颗粒状或帮状，所以又称为中央颗粒；由于推测它在核质交换中起一定作用，所以还把它叫做“transporter”。 2核孔复合体的成分 核孔复合体主要有蛋白质组成，大约含有1000多个蛋白质分子。已鉴定的脊椎动物的核孔复合体蛋白成分已达到十余种

7、。 gp210代表一类结构性跨膜蛋白，位于核膜的“孔膜区”，故认为它在锚定核孔复合体的结构上有重要作用。目前认为它有三个功能：介导核孔复合体与核被膜的连接，将核孔复合体锚定于“孔膜区”，从而为核孔复合体装配提供一个起始点；在内、外核膜融合形成核孔中起重要作用；在核孔复合体的核质交换功能活动中起一定的作用。 p62代表一类功能性的核孔复合体蛋白，脊椎动物p62主要有两个区域：疏水性N端区，具有FXFG(F：苯丙氨酸，X：任意氨基酸，G：甘氨酸)形式的重复序列，适合形成-折叠。该区域在核孔复合体功能活动中直接参与核质交换；C端区，具有疏水性的七肽重复序列，适合形成-螺旋。它对核孔复合体行使正常功能

8、非常重要。 3核孔复合体的功能：核质交换的双向选择性亲水通道 从功能上讲，核孔复合体可以看作是一种特殊的跨膜运输蛋白复合体，且是一个双功能、双向性的亲水性核质交换通道。双功能表现在它有两种运输方式：被动扩散与主动扩散；双向性表现在既介导蛋白质的入核转运，又介导RNA、核糖体蛋白颗粒(RNP)的出核转运。 (1)通过核孔复合物的被动扩散。 通过将PVP包被的胶体金颗粒，通过显微注射引入变形虫细胞质，然后在电镜下检查金颗粒的分布，结果发现它们是经过核孔复合物的中心进入细胞核的。再根据一些定量分析资料推断，核孔复合物是一个圆形亲水通道。 (2)通过核孔复合体的主动运输。其主动运输具有选择性，表现在：

9、对运输颗粒大小的限制，像核糖体亚单位那样大的RNP颗粒也可以通过核孔复合物从核内运输到细胞质中，说明核孔复合体的有效直径的大小是可被调节的；通过核孔复合体的主动运输是一个信号识别与载体介导过程，需要消耗ATP能量，爪蟾卵母细胞核质蛋白注射实验，证实核定位信号的存在；通过核孔复合体的主动运输具有双向性，即核输入和核输出。 4亲核蛋白(karyophilic protein) 是指在细胞质内合成后，需要或能够进入细胞核内发挥功能的一类蛋白质。大多数的亲核蛋白往往在一个细胞周期中一次性被转运到核内，并一直停留在核内行使功能活动，典型的如组蛋白、核纤层蛋白等。但也有的一些亲核蛋白需要穿梭于核质之间进行

10、功能活动，如importins。 通过研究核质蛋白(nucleoplasmin)的入核转运，人们逐渐发现了指导亲核蛋白入核的信号。现已知，亲核蛋白一般都含有特殊的氨基酸序列，这些内含的特殊短肽保证了整个蛋白质能够通过核孔复合体被转运到细胞核内。这段具有“定向”、“定位”作用的序列称为核定位序列或核定位信号(nuclear localization sequence or nuclear localization signal，NLS)。目前认为，NLS是存在于亲核蛋白内的一些短的氨基酸序列片段，富含碱性氨基酸残基。 亲核蛋白通过核孔复合体的转运机制：亲核蛋白通过NLS识别importin，与可

11、溶性NLS受体importinimponin异二聚体结合，形成转运复合物。这一步不需要能量；在importin的介导下，转运复合物与核孔复合体的胞质纤维结合；)转运复合物通过改变构象的核孔复合体从胞质面被转移到核质面；转运复合物在核质面与Ran-GTP结合，并导致复合物解离，亲核蛋白释放；受体的亚基与结合的Ran返回胞质，在胞质内Ran-GTP水解成Ran-GDP并与importin解离，Ran-GDP返回核内再换成Ran-GTP。 二、染色质 (一)染色质是细胞生命活动的基础 染色质是指问期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的线性复合结构，是间期细胞遗传物质存在的形式。染色体

12、是指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中，由染色质聚缩而成的棒状结构。两者的区别，不在于化学组成的差异，而在于包装程度的不同。反映了它们处于细胞周期的不同的功能阶段。在真核细胞的周期中，大部分时间是以染色质的形态而存在的。 染色质是遗传信息的载体，是一切生命活动的基础。 (二)染色质DNA 凡是具有细胞形态的所有生物遗传物质都是DNA，只有少数病毒遗传物质是RNA。在真核细胞中，每条未复制的染色体包装一条DNA分子。一个生物储存在单倍染色体组中的总遗传信息，称为该生物的基因组(genome)。生物基因组的遗传信息大体上可分为两类： (1)负责编码蛋白质的信息，以三联体密码(triplet)方式进行编

13、码，巧妙地解决了在有限的小空间储存大量遗传信息的矛盾。 (2)中度重复序列DNA，它们是关于基因选择性表达的信息。即不同的物种、个体发育的不同阶段、不同的组织以及不同的细胞类型中，各种基因是关闭还是表达，表达的强度如何，都是不相同的。 中度重复序列又分为两类：短散在重复元件(short interspersed elements，SINEs)，典型的SINEs其长度少于500bp，如人和灵长类基因组中大量分散存在的Alu家族；长散在重复元件(long interspersed elements，LINEs)，典型的LINEs其长度多于1000bp，如人基因组中L1家族。 此外，真核细胞基因组中

14、，还含有高度重复的DNA序列，约占脊椎动物总DNA的10。高度重复DNA序列由一些短的DNA序列呈串联重复排列，可进一步分为几种不同类型：(1)卫星DNA(satellite DNA)，主要分布在染色体着丝粒部位。(2)小卫星DNA(minisatellite DNA)，又称数量可变的串联重复序列，每个小卫星区重复序列的拷贝数是高度可变的，因此常用：DNA指纹技术(DNA finger-printing)作个体鉴定。(3)微卫星：DNA(microsatellite DNA)重复单位序列最短，只有1-5bp，串联成簇长度50100bp的微卫星序列。人类基因组中至少有30000个不同的微卫星位点

15、，具高度微卫星多态性，不同个体间有明显差别，但在遗传上却是高度保守的，因此可作为重要的遗传标志，用于构建遗传图谱(genetic map) 生物的遗传信息储存在DNAA的核苷酸序列中，其生物多样性也储存在DNA分子4种核苷酸的不同排列之中。DNA分子不仅有一级结构多样性，而且二级结构也具有多形性(polymorphism)。所谓DNA二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。DNA二级结构构型可分为三种：B型DNA(右手双螺旋DNA)，是“经典”的Watson-Crick结构。细胞内天然DNA大多为此型；A型DNA，是一般B型DNA的重要变构形式，同样是右手双螺旋DNA；Z型D

16、NA，是左手螺旋，也是B型DNA的变构形式。 三者的比较如表10-1所示。 (三)染色质蛋白质 染色质DNA结合蛋白负责DNA分子遗传信息的组织、复制和阅读。DNA结合蛋白包括两类：组蛋白(histone)，与DNA非特异性结合；非组蛋白(nonhistone)，与DNA特异性结合。 1组蛋白 组蛋白是构成真核生物染色体的基本结构蛋白，富含带正电荷的Arg和Lys等碱性氨基酸，等电点一般在pH10以上，属碱性蛋白质。用聚丙烯凝胶电泳可以将组蛋白分为5种组分：H1、H2A、H2B、H3和H4。 5种组蛋白在功能上分为2组： (1)核小体组蛋白(nucleosomal histone)，包括H2B

17、、H2A、H3和H4，这4种组蛋白有相互作用形成聚合体的趋势，它们通过C端的疏水氨基酸互相结合，而N端带正电荷的氨基酸则向四面伸出以便与DNA结合，从而帮助DNA卷曲形成核小体的稳定结构。这4种组蛋白没有种属及组织特异性。 (2)H1组蛋白，其球形中心在进化上保守，而N端和C端两个“臂”的氨基酸变异较大，故H1在进化上不如核小体组蛋白保守。在构成核小体时H1起连接作用。H1有一定的种属和组织特异性。 2非组蛋白 与染色体组蛋白不同，非组蛋白主要是染色体上与特异DNA序列相结合的蛋白质，故又称为序列特异性DNA结合蛋白(sequence specific DNA binding proteins

18、)。 (1)非组蛋白的特性。 1)非组蛋白具多样性和异质性：非组蛋白占染色体蛋白的6070，包括多种参与核酸代谢与修饰的酶类如DNA和RNA聚合酶、HMG蛋白(high mobility group proteins)、核质蛋白、染色体骨架蛋白、肌动蛋白和基因表达调控蛋白等。 2)对DNA具有识别特异性：能识别特异的DNA，识别信息来源于DNA核苷酸本身，识别位点存在于DNA双螺旋的大沟部位。识别与结合靠氢键和离子键。这类序列特异性DNA结合蛋白具有一个共同特征，即形成与DNA结合的螺旋区并具有蛋白二聚化的能力。 3)具有多种功能：包括基因表达的调控和染色质高级结构的形成，如帮助DNA分子折叠

19、，以形成不同的结构域，协助启动：DNA复制，控制基因转录，调节基因表达。 (2)序列特异性DNA结合蛋白的不同结构模式。 1)螺旋-转角-螺旋模式(helix-turn-helix motif)：这是一种最简单、最普遍的DNA结合蛋白的结构模式。这种蛋白与DNA结合时，形成对称的同型二聚体(symmetric homodimer)结构模式。 2)锌指模式(Zine finger motif)：每个锌指单位是一个DNA结合结构域(DNA-banding domain)，每个锌指的C端形成螺旋负责与DNA结合。 3)亮氨酸拉链模式(Leucine zipper motif，ZIP)：亮氨酸拉链是一

20、种富含Leu残基的一段氨基酸序列所组成的二聚化结构。所有这些蛋白的肽链C端约35个氨基酸残基形成螺旋的特点，每两半圈(7个氨基酸残基)有一个亮氨酸残基。这样，在螺旋一侧的Leu排成一排，两个蛋白质分子的螺旋之间靠Leu残基之间的疏水作用力形成一条拉链状结构。 4)螺旋-环-螺旋结构模式(helix-loop-helix motif，HLH)：HLH由4050个氨基酸组成两个两性螺旋，两个螺旋中间被一个或几个转角组成的环区所分开。具有疏水面和亲水面的两性螺旋有助于二聚体的形成。具有HLH的蛋白家族成员之间形成同源或异源二聚体是这类蛋白与DNA结合的必要条件，缺失螺旋的二聚体不能牢固结合DNA。

21、5)HMG框结构模式(HMG-box motif)：高速泳动族蛋白(high mobility group proteins)结构有三个螺旋组成boomerang-shaped结构模式，具有弯曲DNA的能力，因此具有HMG框结构的转录因子又称“构件因子”(architectural factors)，它们通过弯曲DNA、促进与邻近位点相结合的其他转录因子的相互作用而激活转录。 (四)染色质的基本结构单位核小体 核小体(nucleosome)是染色质包装的基本结构单位。 1主要实验证据 (1)用温和的方法裂解细胞核，将染色质铺展在电镜铜网上，通过电镜观察，未经处理的染色质自然结构为30nm的纤丝

22、，经盐溶液处理后解聚的染色质呈现一系列核小体彼此连接的串珠状结构，串珠的直径为10nm。 (2)用非特异性微球菌核酸酶消化染色质时，发现绝大多数DNA被降解为大约200bp或其整数倍的片段。如果用同样方法处理裸露的DNA，则产生随机大小的片段群体。 (3)应用X射线衍射、中子散射和电镜三维重建技术，研究染色质结晶颗粒，发现核小体颗粒是直径为11nm、高60nm的扁圆柱体，具有二分对称性。 (4)SV40微小染色体分析。用SV40病毒感染细胞，病毒DNA进入细胞后，与宿主的组蛋白结合，形成串珠状微小染色体，电镜观察SV40 DNA为环状，周长1500nm，约50kb。若200bp相当于一个核小体

23、，则可形成25个核小体，实际观察到23个，与推断基本一致。如用025molL盐酸将SV40溶解，可在电镜下直接看到组蛋白的聚合体，若除去组蛋白，则完全伸展的DNA长度恰好为50kb。 2核小体的结构要点 (1)每个核小体单位包括200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体以及一个分子的组蛋白H1。 (2)组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心颗粒，相对分子质量为100kD，由四个异二聚体构成，包括两个H2AH2B和两个H3H4。 (3)146bp的DNA分子超螺旋盘绕在组蛋白八聚体175圈。组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bpDNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。 (4)两个相邻

24、的核小体之间以连接DNA相连，典型长度60bp，不同物种变化值为O80bp不等。 (5)组蛋白和DNA之间的相互作用主要是结构性的，基本不依赖于核苷酸的特异序列。实验表明核小体具有自组装的特性。 (6)核小体沿DNA的定位受不同因素的影响。 (五)染色质组装的模型 人的46条染色体共含有DNA约6109bp，总长达2m，平均每条染色体DNA分子长约5cm，而细胞核的直径只有约58m，这意味着从染色质DNA包装成染色体要压缩近万倍，相当于一个网球含有2km长的细线。 1染色质包装盼多级螺旋模型 由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠状结构，

25、这是染色质包装的一级结构。在电镜下可见直径为30nm的染色质纤维。 在组蛋白H1存在下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成一个螺线管(solenoid)。螺线管是染色质包装的二级结构。染色体经温和处理后，在电镜下可看到直径04m、长1160m的染色线，称为单位线(unit fiber)，单位线经螺旋管进一步螺旋化形成直径04m的圆筒状结构，称为超螺旋管(supersolenoid)，这是染色体包装的三级结构。如果螺旋管进一步螺旋折叠，形成长210m的染色单体(chromatid)，即为染色质包装的四级结构。 根据多级螺旋模型(multiple coiling mode

26、l)，从DNA到染色体经过四级螺旋包装形成的染色体结构，共压缩了8400倍。2染色体的骨架一放射环结构模型(scaffold radial loop structure model)HeLa细胞中期染色体经处理，除去组蛋白和大部分非组蛋白后，在电镜下观察到由非组蛋白构成的染色体骨架(chromsomal scaffold)和由骨架伸出的无数的DNA侧环。环状结构域(looped do-mains)可能是染色体高级结构的普遍特征。该模型认为，双螺旋DNA与组蛋白八聚体构建成连续重复的核小体串珠结构，然后按每圈6个核小体为单位盘绕成螺旋管，由螺旋管形成DNA复制管，每18个复制环呈放射状平面排列，

27、结合在核基质上形成微带(miniband)。微带是染色体高级结构的单位，大约106个微带沿纵轴构建成染色体。 上述两种关于染色体高级结构的组织模型，前者强调螺旋化后者强调环化与折叠。各有一定的实验证据。 (六)常染色质和异染色质 间期染色质按其形态特征与染色性能分为两种类型常染色质(euchromatin)和异染色质(heterochromatin)。 常染色质是指间期核内染色质纤维折叠压缩程度低，处于伸展状态，用碱性染料染色时，着色浅的那些染色质。构成常染色质的DNA主要是单一序列DNA和中度重复序列DNA(如组蛋白基因和tRNA基因)。常染色质并非所有基因都具有转录活性，处于常染色质状态只

28、是基因转录的必要条件。 异染色质是指间期核中，染色质纤维折叠压缩程度高，处于聚缩状态，用碱性染料染色时，着色深的那些染色质。异染色质分为结构异染色质或组成型异染色质(constitutive heterochromatin)和兼性异染色质(facultative heterochromatin)。结构异染色质指的是各种类型的细胞，除复制期外，在整个细胞周期均处于聚缩状态。在间期中，结构异染色质聚集形成多个染色中心(chromocenter)。兼性异染色质是指在某些细胞类型或一定的发育阶段，原来的常染色质聚缩，并丧失基因转录活性，变为异染色质。 三、染色质结构与基因活化 按功能状态的不同可将染色

29、质分为活性染色质和非活性染色质。所谓活性染色质，是指具有转录活性的染色质，非活性染色质是指没有转录活性的染色质。 染色质DNA和组蛋白的修饰，可以影响基因的活性。 四、染色体 染色体(chromosome)是细胞在有丝分裂时，遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。 (一)中期染色体的形态结构 中期染色体由两条相同的姐妹染色体(sister chromatid)构成，彼此以着丝粒相连。根据着丝粒在染色体上的位置，可分为四种类型： (1)中着丝粒染色体(metacentric chromosome)，两臂长度相等或大致相等。 (2)亚中着丝粒染色体(submeacentric

30、 chromosome)。 (3)近端着丝粒染色体(acrocentric hcromosome)，具有微小短臂。 (4)端着丝粒染色体(telocentric chromosome)。 染色体各部的主要结构： (1)着丝粒(centromere)与动粒(又称着丝点，kinetochore)。着丝粒连接两个染色单体，并将染色单体分为两臂：短臂(p)和长臂(q)，由于着丝粒区浅染内缢，故称主缢痕(primary constriction)。 (2)次缢痕(secondary constriction)。除主缢痕外，在染色体上其他的浅染缢缩部位称为次缢痕。它的数目、大小、位置是某些染色体所特有的形

31、态特征，因此也可作为鉴定染色体的标记。 (3)核仁组织区(nucleolar organizing region，NOR)。位于染色体的次缢痕部位，但并非所有的次缢痕都是NOR。染色体NOR是rRNA基因所在部位(5S rRNA基因除外)，与间期细胞核仁形成有关。 (4)随体(satellite)。指位于染色体末端的球形染色体节段，通过次缢痕区与染色体主体部分相连。它是识别染色体的重要形态特征之一，有随体的染色体称为sat染色体。 (5)端粒(telomere)。端粒是染色体两个端部特化结构。一个基因组内的所有的端粒都是由相同的重复序列组成，但不同物种的端粒的重复序列是不同的。端粒的生物学作用

32、在于维持染色体的完整和个体性，与染色体在核内的空间排布及减数分裂时同源染色体配对有关。 (二)染色体DNA的三种功能元件 为确保染色体的复制和稳定遗传，染色体应具备三种功能元件(functional elements)：一个DNA复制起点，一个着丝粒，在染色体的两个末端必须有端粒。 (1)自主复制DNA序列(autonomously replicating DNA sequence，ARS)。 根据不同来源的ARS的DNA序列分析，发现ARS都有一段1114bp的同源性很高的富含AT的共有序列(consensus sequence)，同时证明，这段序列及其上、下游各200bp左右的区域是维持ARS功能必需的。现用双向电泳定位复制点技术证明，ARS在质粒以及酵母染色体上与复制起点(replication origin)共定位。