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1、review抗菌肽及其基因工程表达研究概况抗菌肽及其基因工程表达研究概况当前，细菌性感染和疾病呈上升趋势，细菌耐药性的形成是一个重要的原因。由耐药性细菌，如耐药性结核杆菌、大肠杆菌和被称为“超级细菌”耐甲氧西林金葡菌( MRSA)24等对人和动物造成的危害日趋严重。如何克服细菌的耐药性是当前的研究重点和热点。科研工作者们正努力寻求新的抗菌策略，这些策略包括：合理应用抗生素；改造现有抗生素或研发新的抗生素；微生态制剂的研究与应用；噬菌体制剂研究与应用；中草药细菌耐药抑制剂研究与应用；抗菌肽研究与应用等。其中抗菌肽研究与应用是最有前景的一个领域。1.抗菌肽的生物活性及作用机制1.1抗菌肽的抗细菌作

2、用在APD数据库中有1158个抗细菌肽，至少有113种以上的不同细菌均能被抗菌肽所杀灭。抗菌肽的抗菌作用机理的研究比较多。一是基于膜攻击作用的杀菌机制有一下几个模型1，2：（1）桶板模型(barrel-stave model)：带正电荷的含-螺旋抗菌肽单体与细胞膜上带负电荷的磷脂分子相互吸引而结合在细胞膜表面，多个抗菌肽分子形成多聚体，扰乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排序，并以与膜表面垂直的排列方式将疏水基团插到磷脂双分子层，形成横跨细胞膜的离子通道，造成细胞质物质泄漏和电化学势丧失，细胞膜崩解而导致细胞死亡。（2）地毯模型 (carpet model)：以该机制杀菌的抗菌肽并不插入细胞膜内部，

3、但在电荷作用下，一定浓度的抗菌肽像地毯样展开平行排列在细胞膜表面或形成颗物，利用疏水作用和分子张力作用改变细胞膜的表面张力，从而在细胞膜上出现暂时的孔洞，除了细胞液的相互渗透，抗菌肽还可通过此孔洞进入细胞。（3）穿孔螺旋模型（toroidal-hole model）：抗菌肽分子的极性端与磷脂分子的极性端相对一起形成以螺旋状形式的连续翻转，从而导致膜的完整性破坏和功能丧失；（4）分子团聚集式(micellar aggregate)：抗菌肽分子以不规则形式聚集于膜表面，类似地毯式模型的作用形成跨膜电势差而导致膜损伤。二是基于抗菌肽的非膜结构破坏型机制，包括抗菌肽穿过细胞膜或核膜，作用于胞内DNA、

4、RNA，酶和蛋白质等分子，可抑制细胞外膜蛋白质，细胞壁的合成，抑制细胞的呼吸作用。如Carlsson等研究发现，attacin能够抑制大肠杆菌细胞外膜蛋白相关基因的转录，导致细胞的通透性增加，从而抑制细菌生长3。Fehlbaum 等用40M 的昆虫抗菌肽thanatin 处理大肠杆菌1 h 后细胞呼吸作用明显变弱，处理6 h 时后呼吸作用则完全停止，从而推断thanatin 可能是通过抑制细胞的呼吸作用杀灭细菌。1.2 抗菌肽的抗病毒作用 目前在APD数据库中有97个抗病毒肽，研究证明抗菌肽可以3种不同的机制起到抗病毒的作用：（1）可直接与病毒颗粒相互作用，如-防御素等直接与对疱疹病毒粒子相结

5、合而起作用；（2）干扰病毒的侵染过程，蜂毒素及其类似物K7I的结构与烟草花叶病毒衣壳蛋白的部分氨基酸序列存在相似性，以伪装成病毒包被蛋白，干扰病毒的正常组装；（3）抑制病毒的复制，蜂毒素和杀菌肽A可抑制HIV的复制。1.3 抗菌肽对真菌的作用 目前在APD数据库中有97个抗真菌肽。来源于哺乳动物的防御素对一些人类致病真菌具有杀伤作用；截取天蚕素A和蜂毒索分子的片段，合成杂合肽分子处理真菌孢子原生质体，发现不但真菌细胞壁无法恢复，而且细胞也被破坏，无法保持正常的细胞形态。抗菌肽抗真菌的作用机理包括：（1）阻止、破坏真菌细胞壁的合成，如棘球白素（echinocandins）是1，3-葡聚糖合成酶的

6、抑制物，通过非竞争性抑制葡聚糖的合成而抑制真菌细胞生长；（2）与真菌细胞内线粒体、核酸等大分子细胞器相互作用导致真菌死亡；（3）攻膜作用，在脂膜上形成孔洞，使重要的内容物外泄。1.4 抗菌肽的抗原虫作用 部分抗菌肽可以有效地杀灭寄生于人类和动物的寄生虫。杀菌肽的类似物Shiva I在体外可以杀死恶性疟原虫4；杀菌肽蜂毒素的杂合肽可以杀伤利什曼鞭毛虫。抗菌肽杀灭寄生虫时主要作用于寄生虫细胞质膜，损坏质膜形态，迅速降低WOH的通透性，破坏膜电势。1.5 抗菌肽的抑制肿瘤细胞作用 目前在APD数据库中还有95个抗肿瘤肽。肿瘤细胞对抗菌肽的敏感度比正常细胞要高，这可能与肿瘤细胞外膜含有较高的酸性磷脂成

7、分有关，而肿瘤细胞的细胞骨架系统不完善，也可能是易受抗菌肽作用的原因。抗菌肽对癌细胞的作用主要是可以插入质膜，使双分子层发生融解、完整性被破坏，细胞膜上形成的孔洞使内容物外泄，线粒体出现空泡化，嵴脱落，核膜破损，界限模糊不清，核染色体DNA断裂，并抑制染色体DNA的合成。抗菌肽的抗肿瘤作用的另外一个可能机制是诱导细胞凋亡。Mai等研究发现，将抗菌肽DP1局部注射到小鼠的体瘤内，DP1 可以迅速诱导肿瘤细胞凋亡，因此诱导细胞凋亡可能是抗菌肽作用机制中的一种5， 6。抗菌肽在体内还可以调节机体的免疫机能，增强机体的免疫力发挥抗肿瘤作用。1.6 抗菌肽其他生理医学作用（1）抗菌肽具有促进创伤愈合、促

8、进血管生成功能。从牛蛙皮肤中分离得到2种具有抗菌活性的多肽，同时检测到其具有对细菌感染创面促进创伤愈合作用。在体内LL-37以剂量依赖性的方式诱导血管内皮生长因子(VEGF)，角质形成细胞生长因子（KGF）等多种细胞生长因子表达，刺激肠上皮细胞生长，保证肠上皮组织屏障的完整性7。（2）抗菌肽的中和、阻断内毒素的作用。来自人的抗菌肽hCAP18 具有通过结合并中和、阻断内毒素的作用，10 mg和100 mg hCAP18 均能够显著抑制由LPS诱导增加的炎性细胞数，降低NO，TNF-，PGE2， MCP-1和MIP-2水平8。（3）抗菌肽的白细胞趋化与免疫激活作用。感染或损伤处所分泌的Cathe

9、licidins和defensins 对效应细胞具有趋化性，诱导化学激活素的转录及分泌和肥大细胞的组胺释放， 这些反应一起则能促进先天的及获得性免疫细胞的补充。LL-37作用宿主Toll样受体， 加强TLR4 mRNA的转录和增加TLR4，引发宿主主细胞（mast cell）释放 IL-4，IL-5，IL-1，激活宿主的先天性免疫9。（4）抗菌肽的炎性及免疫抑制作用。LL-37通过多种作用协同炎症因子IL-1等细胞因子的释放9,10。哺乳动物抗菌肽除了具有促炎性反应外， 也能阻止有害的炎症应答。Cathelicidin家族的抗菌肽能够抑制致炎细胞因子如TNF-，IFN-r和IL-6的相关基因转

10、录、促炎症反应物质的释放及避免细菌感染后啮齿类的脓毒症，还能防止引起阻止损伤和炎症的毒性组分的产生11，研究表明Cathelicidin家族抗菌肽还可通过调节TLR4来调节炎症反应12。（5）免疫调节作用。抗菌肽可以通过对靶细胞的凋亡、基因转录调节、调节巨噬细胞、树突状细胞和其它抗原递呈细胞趋化性的调节作用，调节宿主细胞因子的产生和B细胞和T细胞的抗原特异性免疫应答而作用于先天及获得性免疫7。2 基因工程表达抗菌肽2.1 抗菌肽与原核表达系统现有的表达体系主要包括大肠埃希菌、酵母菌、昆虫细胞/杆状病毒群蛋白表达系统和哺乳动物细胞等4种。最初抗菌肽基因表达研究是在原核表达系统中进行的，但运用该系

11、统表达抗菌肽则比较困难，主要表现在3个方面：1) 大肠埃希菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质翻译后加工修饰能力，其产物往往形成没有活性的包涵体，须经过变性、复性等处理才能应用；2) 抗菌肽的宿主细胞毒性。宿主细胞表达的抗菌肽会反馈性抑制大肠埃希菌的增殖，影响抗菌肽的进一步表达；3)容易被降解。但目前也有多种利用原核表达系统表达的抗菌肽进入期临床试验阶段13，如用脂质体包装的2螺旋型阳离子肽 CM3喷剂也已完成用于治疗支气管和肺部感染的临床实验142.2 抗菌肽与昆虫细胞/杆状病毒群蛋白表达系统Valore等15在昆虫细胞/杆状病毒群蛋白表达系统克隆和表达了 H BD-1 基

12、因。杆状病毒表达系统虽是一个简便高效的体系，但其缺点是外源蛋白处在极晚期病毒启动子调控下，此时细胞已经开始死亡。2.3 抗菌肽与酵母表达系统目前在采用酵母表达系统表达抗菌肽的研究方面取得了较大的成功，酵母表达系统具有表达产物可以糖基化、分泌性表达、表达量高、利于产物分离纯化、 适应工业化生产等优点。 抗菌肽在酵母菌中的表达最为成功的是柞蚕抗菌肽D和绿蝇抗菌肽16。1992年 Reichhart 等17将绿蝇防御素A基因与酵母菌基因启动子重组构建了酵母表达载体PT C3858，分泌培养基中含1g / ml防御素A，经改造加工后可达 2 2. 5 g/ml培养基水平。Hong等18将人皮肤抗菌肽

13、LL-37与酵母表达载体pGAPZ-E重组构建了pGAPZ-E/LL-37载体，转染毕赤酵母X-33，甲醇诱导表达，分泌表达了人皮肤抗菌肽 LL-37，产物纯化后经藤黄微球菌测试具有抗菌活性。尹娜等19根据毕赤酵母密码子的偏爱性，人工合成抗菌肽Cecropin D并克隆到酵母表达载体 pPIC9K，重组表达质粒 pPIC9K-D 转化至毕赤酵母菌GSI15，甲醇诱导表达，经Tricine-SDS-PAGE 检测，在相对分子质量3. 9 ku处出现目的蛋白表达条带，获得的抗菌Cecropin D对部分革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。陆建荣等20将毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9 5- UTR

14、内GGATCCAA 序列去除，构建改良的重组表达载体 pPIC9 ED-IT-LL-37，原生质球法转化毕赤酵母GS115。结果表明改建后LL37 蛋白表达量提高了约 35 倍。王婷婷等21构建了家蝇抗菌肽Attacin基因多拷贝串联体，并克隆到甲醇酵母分泌表达栽体 pPIC9K上，为进一步进行高效表达打下了基础。 Jin 等22将cecropin A 的1 8个氨基酸序列和magainin 2的1 12 个氨基酸序列连在一起，构建了酵母表达载体 pPIC-ZaA/CA-MA，转染毕赤酵母 SMD1168，流式发酵罐发酵液中目的蛋白含量可达到 22 mg/ L。纯化后的表达蛋白比 cecrop

15、inA 和 magainin 2 具有更广的杀菌谱和更高的抗菌活性。 牛明福等23将抗菌肽 Proteg rin 1( PG-1)、Scorpion Defensin( SD)、 Metalnikowin 2A 和 Sheep Myeloid Antibact erial Peptide( SMAP -29) 成熟肽段作为模板序列，设计并人工合成了复合抗菌肽 pl 基因，同时用SOE法获得 Scorpion Defensin的基因，分别克隆到pPICZaA载体中，转染酵母菌 X -33，复合抗菌肽pl及sD均获得表达。结果显示复合抗菌肽pl及sD具有很强的热、酸稳定性，而针对不同的细菌，复合抗

16、菌肽则表现出了强于单独的sD的活性，特别是对大肠杆菌。 研究发现，在以酵母为宿主菌的抗菌肽基因工程中，多数研究都实现了目的蛋白的表达，产物对工程菌没有明显的抑制作用，表明抗菌肽对酵母的毒性较小， 适于在该系统中表达。为了使表达量增高，采用了各种不同的表达策略， 直接表达、融合表达、改造后表达、串联表达和复合表达等，都有一定的预期结果。说明应用酵母表达抗菌肽具有很好的开发前景。3抗菌肽研究存在的问题目前，研发绿色、新型、高效、低毒、广谱的抗菌制剂已成为全球的热潮。新型抗菌肽不断被发现，天然来源的抗菌肽已不能满足进一步对其作用机理及其高级结构研究的需要。天然抗菌肽的人工修饰最大限度提升抗菌肽的抗菌

17、活性。虽然抗菌肽的研究时间不长，大量研究结果预示，抗菌肽的应用将带来生物医药领域的一场“绿色革命”，但magainin，indolicidin，protegrin等体外抗菌活性较好的抗菌肽已进入临床超过10年，还存在抗菌活性较弱，非特异性毒性作用和对蛋白酶敏感等问题而限制其应用。真正将抗菌肽推向市场，应用于临床可能还要面临很多挑战，还必须继续深入研究以下几个问题。3.1 抗菌肽的来源问题 在动物体内天然含量极微，天然资源有限；其次，抗菌肽分子量小，分离纯化困难，提取步骤烦琐、得率低；再次，抗菌肽化学合成成本高，价格昂贵。如何提高抗菌肽的产量，降低生产成本的难题成为目前抗菌肽研究与应用的瓶颈。3

18、.2抗菌肽的活性/毒性问题 虽然基因工程抗菌肽在一级结构上与天然抗菌肽一致，却无法保证空间结构上的一致而造成活性差异。另外，天然防腐剂的抗菌谱较窄，客观上使其应用领域受到了限制。 至今尚无资料表明抗菌肽的体内毒性问题。但抗菌肽可能会引起过敏反应，仅用于局部治疗；许多天然抗菌肽都有溶血性。3.3 抗菌肽的体内稳定性问题 抗菌肽一级结构中由于含有多个碱性氨基酸残基(如赖氨酸、精氨酸)而容易被胰蛋白酶水解，从而限制了抗菌肽作为抗感染药物的体内使用。开发同时具有抗菌活性与胰蛋白酶抑制剂活性的双功能多肽，为解决抗菌肽作为药物的体内使用遇到的蛋白酶水解问题提供了新的方法。3.4 抗菌肽的耐药性问题 由于抗

19、菌肽或者细胞应激反应因子触发病原体产生的一种耐药性机制，这种机制包括：微生物对抗菌肽的应激协同反应，蛋白酶介导的耐药性，细胞内外靶位的修饰和抗菌肽的外排作用等。例如：对E. coli和P. fluorescens进行持续600700 代的筛选，22/24谱系独立进化出了可遗传的对阳离子抗菌肽exiganan 的耐药性24。金黄色葡萄球菌除可分泌蛋白酶降解抗菌肽产生耐药性外，还可以通调节vraDE和vraSR 改变膜的转运作用而产生对蛙类抗菌肽temporin L和dermaseptin K4-S4的耐药性。3.5 抗菌肽在生命体防御系统中准确地位以及模式生物研究 抗菌肽表达水平与各种疾病具有相

20、关性。抗菌肽、防御素与消化系统疾病如幽门螺杆菌感染、炎症性肠病、消化道肿瘤的关系已成为研究热点，但缺少用于研究的生物模型而制约研究的发展。3.6 抗菌肽的基因工程表达存在的问题 基因工程表达抗菌肽存在的问题主要有：抗菌肽分子小，易被蛋白酶降解，缺乏检测抗菌肽方法。基因的表达产物可能对宿主有害。目的基因在宿主基因组中的随机整合有可能造成宿主染色体突变，同时也可能影响其他基因的表达。转抗菌肽基因动植物阳性率偏低及其最终应用时的安全性还有待研究等。寻找有效的抗生素的道路困难重重，开发出一种新的抗生素需要耗时日久。在抗生素耐药性日益严重、病毒病和肿瘤仍未攻克的今天，抗菌肽的出现无疑为人们寻找理想的抗菌

21、、抗病毒和抗肿瘤药物提供了新的领域，抗菌肽的应用将给解决细菌抗药性、药物残留等关键问题带来希望。新型、高效、低毒、广谱的抗菌肽将会在农业、食品、卫生用品、医药、化妆品、生物农药、生物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程等领域发挥重要的作用，为人类创造巨大的价值。4 参考文献1Lai Y, Gallo RL,et al. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense J. Trends Immunol, 2009, 30(3): 131-41.2Reddy KV,

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