人血清白蛋白抗体的制备及多种免疫学方法的初步建立.docx

1、人血清白蛋白抗体的制备及多种免疫学方法的初步建立第一章 绪 论1.1引言心脑血管疾病和糖尿病与肿瘤并称为人类健康三大杀手。世界卫生组织（WHO）统计，全球每年有1860万人死于心脑血管疾病。2005年，据国家卫生部统计，我国每年有400万人死于此病，占死亡人数的60%以上。目前我国有6000万人患有冠心病，7000万人患有脑梗塞或者心脑溢血，40岁以上的人中57%的人都患有不同程度的心脑血管病；近期，国际糖尿病联盟（IDF）主席阿尔特教授对糖尿病发病现状与发展趋势进行了统计，其结果令人震惊：目前全球已诊断的型糖尿病患者达1.3亿人，我国的确诊人数为4000万，位居世界第二，并以每年100万的速

2、度递增。WHO指出：如果不采取重大措施，2025年世界将出现3.8亿名糖尿病患者。因此，对心血管疾病和糖尿病的早期诊断有重要的临床意义。人血清白蛋白（HSA）是人体血清中含量最丰富的一种蛋白质，分子量为69KDa，是一种带有负电荷的大分子蛋白。白蛋白的直径为7.2nm，肾小球毛细血管基底膜孔直径为5.5nm，少量通过基底膜的白蛋白99%可由近曲肾小管重新吸收1。因此，正常情况下只有极少量的白蛋白可以通过尿液排出到体外。如糖尿病、心血管疾病、肾小球肾炎以及涉及肾脏病变的自身免疫性疾病2，能影响肾小球毛细血管基底膜通透性和肾小管重吸收功能的疾病都可导致原尿中白蛋白病理性升高。尿蛋白的多少在很大程度

3、上同病情的变化成正相关。一般情况下，尿蛋白轻度增加表示肾小管损害，而明显升高则常见于严重的肾小球病变。因此，尿中微量白蛋白的检测对于与肾脏受损有关的疾病的早期诊断有重要的意义。1.2 尿微量白蛋白的研究进展1.2.1尿微量白蛋白的定义尿微量白蛋白（MA）于1974年首次被提出并应用于临床，至80年代Mogensen将它作为糖尿病肾病的亚临床过渡阶段，尿微量白蛋白从而成为糖尿病肾病早期诊断的重要指标3。尿微量白蛋白是指尿中白蛋白含量超出健康人参考范围，但不能用常规的生化方法检测这种微量的变化，是尿白蛋白的亚临床表现。一般定义为尿白蛋白排泄率（AER）20200g/min4，或30300mg/d5

4、，或夜间尿标本排泄率15150g/min，这一临界值是根据发生糖尿病肾病的危险因素来界定的，它不能界定心血管疾病的危险增加。近期的一项报告称，在一般人群中，整夜尿白蛋白排泄量大于5mg/min就已经是冠心病和死亡的强预测指标了，同时糖尿病病人尿白蛋白在低于MA临界值时，就已经表现有心血管疾病危险的增加6。因此，许多研究者建议重新修改普通人群中MA的定义，然而由于各个实验室尿标本收集及检测方法存在的差异，限制了这些实验数据的可比性。对于尿微量白蛋白的定义还有待进一步的研究和统一。1.2.2尿微量白蛋白检测的临床意义发现微量白蛋白尿，进行早期综合治疗，会给肾脏带来康复的机会。因此，在糖尿病肾病的诊

5、断中，微量白蛋白尿的检测显得尤其重要。不仅如此，近年来的研究还发现，尿微量白蛋白阳性是血管损伤的早期标志，也是糖尿病合并心血管疾病的危险因素，与型糖尿病、型糖尿病及高血压的预后均有密切关系。1.2.2.1 尿MA在糖尿病肾病(DN)诊断中的临床意义糖尿病（DM）已经逐渐成为人类健康第三大杀手，它对肾脏的影响是一个隐匿的发展过程。糖尿病肾病（DN）是糖尿病的重要并发症之一。糖尿病肾病早期，患者无任何不适症状，检查可发现微量白蛋白尿；临床蛋白尿期，以蛋白尿为特征，伴有水肿和血压升高；最后进入临床终末肾病期，出现肾功能衰竭、尿毒症7。 目前，糖尿病肾病的诊断还没有统一的标准，尿中白蛋白排泄增加是糖尿

6、病肾病的主要特征之一，可以通过检测尿微量白蛋白帮助其在肾组织损伤的早期诊断8。Parving等9采用放射免疫扩散法对23例长期胰岛素依赖性糖尿病人进行检测，结果病患组的尿MA都有一定程度的增高，其中有9例患者的尿MA平均值为115mg/d，而正常对照组的最高值为40 mg/d（P0.05）。黄佳10采用放射免疫法对100例DM患者的尿MA进行检测，结果表明DM组约72%的人尿MA含量有明显的增高，而正常对照组的结果均7 mg/d（P0.001）。另外，杨光等11对138例DM患者做晨尿微量白蛋白、血尿素氮、肌酐检测，结果，血尿素氮、肌酐检测患病组与健康对照组之间没有显著差异（P0.05），而尿

7、微量白蛋白检测有显著差异（P0.01），说明尿MA可以做为诊断糖尿病肾病和肾功能损伤的指标之一。1.2.2.2型糖尿病(T2DM)合并冠心病患者尿MA检测的临床意义尿微量白蛋白是早期诊断DN的重要依据，也是冠心病的独立预测因子12。最近有报道，糖尿病患者心脏功能明显降低可能与其发生冠脉病变有关，而出现尿MA的T2DM患者与一般T2DM患者比较，其动脉血管内皮功能受损更严重，进一步导致左室射血分数更低，最终导致冠心病的发生13。陈凯东14探讨了型糖尿病合并冠心病的危险因素，他将以确诊为型糖尿病的216例患者，根据是否合并冠心病分为A组102例和B组114例进行对照分析。结果，两组患者年龄、性别、

8、BMI、DBP、FBG、TC、GHb1c比较，无显著差异性（P0.05）；糖尿病病程、血压、尿微量白蛋白比较，A组明显高于B组（P0.05）。因此，MA能作为T2DM合并冠心病的早期诊断标志。1.2.2.3 尿MA检测在心血管疾病中的临床意义自1974年Parving等15发现某些高血压病人的尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate, UAER）有明显增加之后，大量临床研究结果和流行病学资料证实了UAER的高低与心血管疾病预后明显相关，MA与心血管疾病之间的关系受到人们的高度关注。一些大型临床试验如MARVAL (microalbuminuria reduc

9、tion with valsartan)试验和HOPE(the heartoutcome prevention evaluation study)试验等16表明，伴有微量白蛋白尿的高血压病人的心血管事件的发生率和死亡率较无蛋白尿者明显增加，而经血管紧张素受体拮抗剂(ARB)或血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)等药物治疗后，伴随着心血管事件发生率的明显降低，微量白蛋白尿也表现出下降趋势。这一结果表明尿MA可以作为一项评价心血管疾病治疗效果及预后的指标，具有重大的意义17。1.2.2.4 尿MA在系统性红斑狼疮(SLE)患者中的检测的临床意义系统性红斑狼疮（systemic lupus eryhe

10、matosus, SLE）是常见的自身免疫病之一，病变能累及全身多个组织器官，包括关节、皮肤、肾、肝、心血管等部位和血细胞，尤其以肾脏受累最为常见和严重。SLE患者起病5天就出现肾损害者占50%90%，尽管近十年来随着肾炎治疗的进展，狼疮肾炎(LN)患者生命得以大大延长，但肾炎仍为SLE患者死亡的主要原因18。若能早期观察肾脏受损程度，进行早诊早治，从而改善SLE患者预后，降低病死率。贾支俊、冯雪凤等19人对524例SLE患者的尿液微量白蛋白进行检测，结果发现病程5年的SLE患者组的尿MA含量均出现明显异常，病程510年和10年组与正常组相比较有明显差异(P0.05)。因此，尿MA可作为SLE

11、肾损伤的早期指标之一。尿MA与尿1微球蛋白(1-MG)、尿2微球蛋白(2-MG)及尿免疫球蛋白G( IgG)等其他微量蛋白共同检测，能反映SLE患者肾小球和肾小管双重损害程度，是SLE患者早期肾损害最敏感的指标。综上所述，尿MA的检出不仅是DN的早期表现，也是高血压、心血管疾病的独立危险因素，随着医学技术的发展，它会被越来越多的应用于临床的各个领域。1.2.3 尿微量白蛋白检测方法的进展1.2.3.1 尿样的选取方法目前，尿微量白蛋白检测的尿样的选取存在三种方法：定时取尿法、随机留尿法和24小时留尿法20。定时取尿法：通常的作法是留取临睡前至次晨这一时间段的尿样本进行检测。临睡前排尿、弃去此次

12、的尿样本，并准确记录时间，以后每次夜间排尿均留取尿样本，存于样本收集容器中，清晨排尿、留取样本、准确记录时间。将容器中的尿样本混匀，准确记录尿量，取出一杯尿，送检。检测者将根据尿白蛋白的浓度、尿量及留取尿样的时间计算出每分钟的尿白蛋白排出率。因此，准确记录留尿的时间和尿量对于获得准确的结果是很重要的。24小时留尿法：留取24小时的尿样本，同时可计算肌酐清除率及24小时尿白蛋白排泄率。随机留尿法：随机留取一次尿样本，同时检测尿中的白蛋白及肌酐的浓度，用肌酐比值报告尿白蛋白排出率。上述三种方法中，24h尿mALB排泄率（24h-urinary albumin excretion rate，24h-

13、UAER）是诊断糖尿病肾病的金标准，但因操作繁琐，临床利用率不高。检测单次晨尿或随机尿，因其分析方法简便，广泛应用于临床和科研中。由于尿样标本复杂，后两种方法能否代替24h-UAER，目前尚缺乏科学评价21。但对于后两种方法对DN的诊断试验的有效性，马清光等22人作了相关报道，他利用计算机检索系统，对国外和国内关于“尿微量白蛋白，糖尿病肾病”进行统计，分析晨尿和随机尿两种取尿方法诊断糖尿病肾病的有效性，结果这两种方法的有效性都很高，两者之间差异无统计学意义。1.2.3.2 尿微量白蛋白的检测方法尿微量白蛋白作为糖尿病、心血管疾病等慢性病的早期诊断指标，对其检测方法的研究越来越受到关注。目前应用

14、于尿微量白蛋白检测的方法有很多：（1）RIA法放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）是Yalow RS和Berson SA于20世纪五十年代创建的，随后广泛用于各种物质的检测，Jury DR等23将该法用于检测尿微量白蛋白。实验原理是用125I标记抗原，然后将125I标记抗原(Ag*)和非标记的待测抗原(Ag)对限量的抗人血清白蛋白抗体(Ab)进行直接竞争性抑制反应。Ag*Ab复合物与游离Ag*的分离采用双抗体法，即第一抗体为兔抗HSA抗体, 第二抗体则为羊抗兔IgG抗体, 而且二者可混合在一起作为单一试剂应用，该方法的灵敏度为1 mg/L；另外Mohamed A等24 用

15、聚乙二醇6000为沉淀剂，通过离心分离Ag*Ab复合物与游离Ag*，省去了制备第二抗体的麻烦，该方法的灵敏度为1.3 mg/L。该方法灵敏度高, 特异性强, 但是放射性同位素对人体健康有一定危害，且需要特殊的仪器设备。目前, 此方法作为衡量其他尿微量白蛋白检测试剂盒的参考标准。（2）免疫比浊法(IT)免疫比浊法（immunoturbidimetry，IT）主要包括两类：一类为免疫透射比浊法，另一类为免疫散射比浊法。前者是测定光线通过抗原抗体复合物溶液时的透射光的强度；后者是以激光作光源，测量溶液中抗原抗体复合物的散射光强度。前者使用普通的分光光度计就能测定，而后者需用特殊仪器激光比浊计，但其灵

16、敏度大大高于前者。Watts等25用适当的缓冲液将尿样稀释后，与兔抗HSA抗体反应，然后直接在分光光度计上以340nm波长测定2min内吸光度的变化值，其灵敏度为2.0mg/L。Marre等25以激光作光源，在Behring激光比浊计上测定MA，在设定的时间内能连续读数和自动分配标准、样品和抗血清，通过计算机直接计算出白蛋白含量，每小时可测定240个样品，该法的检测范围为0.34430mg/L，此法较RIA法简便快速，且避免了放射性同位素标记白蛋白的危害。（3）FIA法该法最早用于定量检测MA是Silver27，他用异硫氰酸荧光素（FITC）标记标准的白蛋白抗原，然后和未标记白蛋白样品对限量的抗白蛋白抗体呈竞争性抑制反应，这样最后荧光强度与样品中的MA含量呈负相关，而FI