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1、离体条件下人工诱导菊花DNA甲基化变化硕士论文学校代码：10475学 号：104753050990 河南大学研究生硕士学位论文 离体条件下人工诱导菊花DNA甲基化变化DNA Methylation Alterations of Chrysanthemum（Dendranthema grandiflorum）During in vitro Growth by Artificial Inducement 专 业 名 称：遗 传 学 专 业 代 码： 071007 研 究 方 向：植物表观遗传学 年 级：二00五级 研 究 生 姓 名：聂 丽 娟 导师姓名、职称：王子成 副教授 完 成 日 期：二0

2、0八年五月 论 文 主 题 词：菊花/继代培养/MSAP/DNA甲基化变化/ 5-azaC河南大学研究生硕士学位论文离体条件下人工诱导菊花DNA甲基化变化DNA Methylation Alterations of Chrysanthemum（Dendranthema grandiflorum）During in vitro Growth by Artificial Inducement 作 者：聂 丽 娟导 师：王 子 成二00八 年 五 月目 录摘 要 IAbstract III1 前言 11.1 菊花花期调控现状 11.2 组织培养过程中的遗传变异 11.3 DNA甲基化 21.3.1

3、DNA甲基化的机制 31.3.2 DNA甲基化的生物学功能 51.3.3 DNA甲基化的检测方法 81.4 DNA甲基化抑制剂 91.4.1 DNA甲基化抑制剂的作用机理 91.4.2 DNA甲基化抑制剂在植物上的应用 101.5 本研究的内容、目的和意义 121.5.1 本研究的内容 121.5.2 本研究的目的和意义 122 材料和方法 132.1 材料 132.1.1 供试材料 132.1.2 仪器设备 132.1.3 生化试剂 142.2 方法 142.2.1 菊花组织培养 142.2.2 外植体的灭菌 142.2.3 单芽系的建立 142.2.4 单芽系材料的5-azaC处理 152

4、.2.5 形态学观察 152.2.5.1 丛生芽分化的观察和统计 152.2.5.2 根长的观察和统计 162.2.5.3 开花时间的观察 162.2.6 分子标记的稳定性检测 162.2.6.1 DNA的提取 162.2.6.2 DNA质量检测 172.2.6.3 AFLP分析 172.2.6.4 DNA甲基化分析 192.2.6.5 DNA甲基化变异率计算 213 结果与分析 213.1 菊花组织培养继代过程中的DNA甲基化变化 213.1.1 田间材料与组培苗的基因组DNA甲基化情况比较 223.1.2 不同继代次数之间的甲基化情况比较 243.1.2.1 不同继代次数之间甲基化变化情况

5、分析 243.1.2.2 不同继代次数之间甲基化变化趋势分析 243.2 5-azaC 对菊花表观性状和基因组甲基化的影响 263.2.1 5-azaC处理对墨菊营养生长的影响 263.2.1.1 5-azaC处理对墨菊茎尖生长的影响 263.2.1.2 5-azaC处理对墨菊丛生芽分化的影响 263.2.1.3 去处理后墨菊丛生芽分化状况 283.2.1.4 5-azaC处理对根形态发生的影响 293.2.1.5 5-azaC处理对墨菊开花时间的影响 293.2.2 5-azaC处理对墨菊基因组序列的影响 313.2.3 5-azaC处理对墨菊DNA甲基化水平的影响 313.2.3.1 5-

6、azaC处理降低基因组的DNA甲基化水平 313.2.3.2 5-azaC连续处理引起DNA甲基化持续降低 333.2.3.3 5-azaC处理引起的基因组低水平DNA甲基化在田间培养时能够维持 333.2.3.4 5-azaC处理引起的低水平DNA甲基化在继代过程中可以维持 354 讨论 374.1 5-azaC应用于菊花花期调控的意义 374.2 菊花组织培养过程中的基因组甲基化分析 384.3 5-acaC处理对菊花的表型影响分析 394.3.1 5-acaC处理对菊花营养生长的影响分析 394.3.2 5-acaC处理对菊花生殖生长的影响分析 394.4 菊花经5-acaC处理后的基因

7、组甲基化分析 404.5 本研究的反思与设想 415 结论 426 展望 43参 考 文 献 44缩略词表（Abbreviations） 56版权声明 57致 谢 58摘 要DNA甲基化参与植物基因表达的调控，在植物生长发育过程中起着非常重要的作用。DNA甲基化抑制剂（5-azaC）已被用于因DNA甲基化引起的植物表观遗传研究中，它可以代替低温促进植物开花，提早开花时间。本研究以菊花(Dendranthema grandiflorum)品种墨麒麟为材料，应用甲基敏感扩增多态性（MSAP）技术，对其组织培养继代过程中的甲基化变化进行研究，并通过形态观察和分子分析研究5-azaC对其表型及花期的影

8、响。主要研究结果如下：1. 采用MSAP方法对菊花组织培养继代过程中的DNA甲基化情况进行分析。三个单芽系的组培苗较田间材料均有DNA甲基化增加和去甲基化现象，各单芽系DNA甲基化变异率分别为8.929%、8.902%、8.986%。继代材料较母体均有甲基化变异发生，且变异类型中DNA甲基化减少的比例高于甲基化增加的比例，随着继代次数的增加，两种变异间的差异逐渐减小，比例相近。同时在同一单芽系内的不同次继代个体间有DNA甲基化变化现象。2. 对5-azaC处理的材料与对照的生长发育进行形态观察比较。结果表明，5-azaC处理过的材料茎尖的丛生芽分化数量都少于对照，100mol/L以上高浓度的5

9、-azaC还影响根的形态发生。5-azaC对丛生芽的抑制作用具有时间累加效应和剂量累计效应，同时，5-azaC对丛生芽形成的抑制效应具有稳定性，在去处理后的连续继代过程中，各种浓度条件下的丛生芽分化数量虽然有所上升但仍不及对照。同时，5-azaC处理对开花时间也有影响，各种低浓度处理均能使菊花提前开花，但提前的时间与浓度密切相关，且这种对花期的影响在材料的田间生长过程中具有稳定性。 3. 应用扩增片段长度多态性（AFLP）技术对处理组及对照组的基因组DNA进行分析。从不同浓度5-azaC处理30天材料及对照的叶片中分别提取DNA，EcoR和Mse对基因组DNA进行双酶切，对处理材料的基因组进行

10、序列分析。25对引物组合扩增产生1267条可统计的条带，这些条带在各种浓度5-azaC的处理材料中没有表现出特异性。表明在5-azaC处理过程中基因组DNA序列没有发生变化。 4. 运用甲基敏感扩增多态性（MSAP）标记分析了处理样品与对照组样品间及其去处理后的甲基化变化情况。5-azaC处理引起基因组的DNA甲基化减少，且基因组DNA甲基化水平随抑制剂的浓度增加而减少，同一浓度5-azaC处理条件下，DNA甲基化减少量随处理时间的延长而增加，这些低甲基化水平在去除抑制剂处理后仍能稳定持续。四种低浓度5-azaC处理30天的材料移至田间后，3个位点发生了DNA甲基化增加，8个位点发生甲基化减少

11、，且模式一致。关键词：菊花；继代培养；甲基敏感扩增多态性；DNA甲基化变化；5-氮杂胞嘧啶核苷（5-azaC）AbstractDNA methylation is critical for regulation of plant gene expression, and plays an essential role in plant development. DNA methylation inhibitor (5-azaC) has been used in the studies of plant epigenetics that based on DNA methylation. 5-

12、azaC could substitute the low temperature and promoted plant flowering, ahead of flowering time. Methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) technique was used to study the variation of DNA methylation during continued generation of tissue culture in the moqilin variety of Chrysanthemum（

13、Dendranthema grandiflorum）. Also, the effect of 5-azaC to the morphogenesis and flowering time has been evaluated by developmental phenotypes and DNA molecular marker techniques. The main results are as follows: 1. The DNA methylation status during the successive transfer culture of Chrysanthemum wa

14、s analysised by MSAP technique. The results indicated that three single shoot system of the tissue culture seedling had distinct DNA hypermethylation and demethylation compared to the field materials, the mutation rate were 8.929%、8.902%、8.986% respectively. All the successive transfer materials had

15、 DNA methylation variety compared to the parent materials. During the variation, demethylation were more than hypermethylation. Along with the successive transfer culture, the diversity between the two variety pattern was smaller, and the proportion allmost similar.Meanwhile, the different individua

16、l of each single shoot system also existed DNA variation phenomenon.2. The development of the samples with 5-azaC treatment and the controls were observed. The results indicated that, The number of multiple buds differentiated from treated shoot-tips was fewer than controls. The concentration of 5-a

17、zaC higher than 100mol/L also affect roots morphogenesis. Research indicated that, the inhibiting effect of 5-azaC has time and dose adding domino offect. Meanwhile, the role of 5-azaC to the inhibition of multiple bud was stability. During the successive transfer culture after removed 5-azaC, the n

18、umber of multiple buds differentiation of all treatment were ascend, but also less than control. Meanwhile, 5-azaC even affected the flowering time of Chrysanthemum, of all low concentration 5-azaC treatment promoted flowering. while the time that aheaded was correlated to the concentration, and the

19、se effect to the flowering time were stability when treated materials growth in the field. 3. The genome DNA of treatments and controls were analyzed by amplified fragment lenth polymorphism (AFLP) technique. The DNA were distilled from the leaves of treatments treated by different concentration and

20、 controls after growthed 30 days. The DNA were digested by EcoRand Mse, and 1267 bands were scored using 25 pairs of primers combination. No variation of bands was found during the samples, which suggested that no nucleotide sequence had altered during 5-azaC treatment.4. Methylation-sensitive ampli

21、fication polymorphism (MSAP) technique was used to investigate the DNA methylation status of the treated samples, the materials after removed 5-azaC and the control. 5-azaC caused the genomic DNA methylation decrease. The decrease was increased when 5-azaC concentration was added, and when the mater

22、ials treated by the same concentration of 5-azaC, the decrease was increased with the treated time extend. The demethylation status was stability after 5-azaC was removed. The materials treated by four kinds lowness 5-azaC had 3 sites DNA hypermethylation and 8 sites DNA demethylation when they were

23、 growth in field, and the patterns were consistent. Key words: Chrysanthemum（Dendranthema grandiflorum）；successive transfer culture; MSAP thchnique; DNA methylation variation；5-azacytidine1 前言1.1 菊花花期调控现状菊花（Dendranthema grandiflorum）原产中国，属菊科菊属的多年生草本植物，是我国的传统名花，已有2500年的栽培历史。菊花的品种繁多，叶、花型、瓣型变化很大，不仅是色、香

24、、姿、韵俱佳的中国传统名花，而且为世界四大切花之一，其鲜切花的销售量在国际市场上占30%1，深受世界各国人民的喜爱。研究和应用其花期调控技术，以适应国内外市场的需求，对提高菊花生产技术水平、降低成本、提高产量和质量、抢占国内外市场份额，具有十分重要的意义。菊花从生长到开花有一定的速度和时限，开花不但与菊花品种及本身的开花生理有关，还与不同季节的外界条件密切相关2。在长期的生产和研究实践中，由于生产和供花的需要，广大生产者和科技工作者在菊花的花期调控技术方面开展了许多研究，总结了许多有价值的生产经验和科研成果，使菊花的花期调控技术取得了进展并引向深入，为我国菊花的生产和供应发挥了重要的作用。吴文

25、新等3总结了菊花花期控制的一系列方法，化学控制中，由于植物生长调节剂对植物开花的效应比较复杂，它依调节剂和植物品种不同而异，也与处理的浓度、时间以及外界环境条件密切相关4。因而在菊花花期调控中多采用光照控制和温度控制，目前，冬春季供花主要通过延长光照来推迟开花，而进行遮光处理则可以提早开花3,5，增温处理可加速新陈代射，促进养分积累和花芽分化2。菊花通过光照发育阶段后，若遇2728以上高温天气或1012以下日平均气温，都会影响开花，因而要严格控制温度才能够改变花期。1.2 组织培养过程中的遗传变异组织培养技术（Tissue Culture Technology）是在无菌的条件下将活器官、组织或

26、细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养而成的细胞、组织或个体。这种技术已广泛应用于农业和生物、医药的研究。由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。世界上一些先进国家园艺植物组织培养技术的迅速发展从60年代就巳经开始，并随着生长、分化规律性探索逐步深化，到了70年代仅花卉业就已在兰花、百合、非洲菊、大岩桐、菊花、香石竹、矮牵牛等二十几种花卉幼苗生产上建立起大规模试管苗商品化生产。尽管以Haberlandt 的细胞全能性学说为理论依据，通过植物组织培养进行种苗快繁的技术得到了迅速发展，但

27、随着植物组织和细胞培养研究的不断深入，人们渐渐发现再生植株中存在着广泛的变异。这些变异大多数能通过有性世代和无性繁殖稳定下来，而且涉及的性状十分广泛。20 世纪80 年代初，Larkin 和Scowcroft 首次提出用“体细胞无性系”(som aclone) 一词来概括一切由植物体细胞再生的植株，把再生植株中出现的变异叫做“体细胞无性系变异”( somaclone variation) 6。体细胞无性系变异是植物组织培养中的普遍现象。一般认为组织与细胞培养中有几个技术环节能引起体细胞发生变异，包括外植体材料的种类和选取的部位7、培养基成分8、增殖率和周期性继代以及重复再生和离体保存的时间长短

28、9,10等。Zaffari 等11还发现再生植株出现的表型变异与其较高的内源激素水平和色素含量有关。目前，由组织培养引起的体细胞无性系变异已在甘蔗、马铃薯、烟草、玉米、大麦、黑麦等许多农作物上得到证实，并提供了不少不可多得的遗传资源。在有些作物上还获得了具有很高应用价值的抗性突变体, 使其成为了作物改良的一条新途径12。植物组织培养诱发的变化在遗传和非遗传性改变中得以表达，如突变13，超度含水14和明显的幼龄化或重新激活现象15。已有报道，在组织培养过程中发现的突变体16和表观改变使木本植物体外培养时产生具重要经济价值的幼龄化个体17。但是，一般来讲，在幼苗群体中组织培养诱发的变化常常使质量降

29、低，如，幼苗非纯种或在形态发生阶段或后生阶段形成劣势群体18-20。已有报道指出，组织培养过程导致DNA甲基化类型改变21。1.3 DNA甲基化DNA甲基化（DNA methylation）是指在DNA复制后在甲基转移酶(甲基化酶)催化下将S-腺苷-甲硫氨酸（SAM）上的甲基连接到DNA分子腺嘌呤（A）或胞嘧啶（C）碱基上，进行DNA修饰的过程22。合成过程如图1所示。一般DNA复制后进行甲基化，甲基化完成后再进行下一轮复制，在真核生物基因组中，甲基化反应是最普遍的DNA复制后修饰。一定的DNA甲基化类型在减数分裂或有丝分裂之后能被子细胞遗传，这在生物表观遗传中有着极其重要的作用，被认为是表观

30、遗传的主要形式23。在动物中，5-甲基胞嘧啶主要存在于-CpG-二核苷酸对，在 DNA 双链中呈对称分布。哺乳动物体细胞中约有 2.511.6的胞嘧啶被甲基化。在果蝇中，多数 5-甲基胞嘧啶主要出现在 CpT 和 CpA 二核苷酸对中。而在细菌中，5-甲基胞嘧啶和 N6-甲基腺嘌呤则存在于各种各样的通常对称的序列中。植物中，大约有 2030的核基因组 DNA 胞嘧啶处于甲基化状态24，对称的CpG和CpA（T）pG被证明是甲基化频率最高的25，基因组内也有CpCpG中外侧胞嘧啶甲基化，但频率低于以上两种26,27。不同种属植物的甲基化有很大不同28。烟草中约 30%的胞嘧啶是甲基化的29，拟南

31、芥中只占约 4%，目前还不清楚植物基因组中CpG甲基化和CpNpG甲基化是否有一样的生物学作用。图1 DNA碱基甲基化合成图Fig.1 Synthesis of the minor methylated bases found in DNA1.3.1 DNA甲基化的机制DNA甲基化作用的发生和甲基化水平的高低主要取决于DNA甲基化酶。生物细胞内存在两种甲基化酶活性22：一种为维持型甲基转移酶(maintenance methylase)，以半甲基化的双链DNA为底物，在未甲基化的DNA链的对称位点上（如CG）完成甲基化。该酶催化特异性极强，对半甲基化的DNA有较高的亲和力，使新生的半甲基化DN

32、A迅速甲基化，从而保持了DNA复制及细胞分裂后甲基化模式不变；另一种是从头合成甲基转移酶(denovo synthesis methylase)，作用于非甲基化的DNA链，产生半甲基化的DNA。两种方式如图2所示。图2 DNA甲基化的维持和从头甲基化Fig.2 Maintanance of the methylation pattern at DNA replication and donovo methylation真核生物的DNA甲基化转移酶按照它们的序列同源性和功能可以分为4类。Dnmt1/MET1 类，Dnmt2类，CMT类和Dnmt3/DRM类。第一类，Dnmt1/MET1家族编码CpG维持甲基化酶和低水平的CpNpG的甲基化30