实验室常用液体配制标准操作规程.docx

1、实验室常用液体配制标准操作规程常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二八年九月修订一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统 （责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨 10g，酵母粉5g，用ddH2O配制，再用10M NaOH调pH至(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。2、固体培养基:

2、LB培养基中加入琼脂至，高压蒸汽灭菌15min后使用。3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）： 注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后20度保存，培养细菌时做1000使用。注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。4、%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含卡那霉素。取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后20度保存，培养细菌时做1000使用。

3、注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。5、细菌培养： 配制相应抗性培养基，每试管倒入34ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37，220rpm培养。剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4保存。6、化学感受态制备：1）原理:： 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。将细菌置于0，低渗CaCl2 溶液中时，菌细胞壁和膜的通透性增强，菌体膨胀成球型。外源DNA与Ca2+形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，在经42短暂的热冲击处理（一般热休克90s）

4、后能促进细胞吸收外源DNA复合物。2）仪器、材料与试剂： 超净工作台、低温离心机、摇床、-80冰箱，装液氮的泡沫盒及液氮、50ml的离心管2个，50ml的注射器及小过滤器各1个。高压灭菌的纸张、透气膜、的EP管约350-500个，两块10cm的平皿板及接种环。TB缓冲液：每200ml液体中含、Kcl、PIPES。（注：在电子天平上的误差50mg,因在PH=易溶故先将其它药品用超纯水溶解,并用KOH及HCL调PH至。在加入溶解后用超纯水定溶至相应的量，采用50ml的注射器及小过滤器过滤,一般储存在-20,时间25天,否则易被氧化颜色呈粉红。）LB液体培养基：参见前面介绍。 LB固体培养基：参见前

5、面介绍。1管DH5的菌种3）步骤： 倒无抗性的固体培养板，用接种环沾取感受态甘油菌画线,置于37恒温培养箱中培养过夜。 在超净台里采用小枪尖挑取培养板中的单克隆菌(菌落的大小约23mm)转接于200250ml的LB液体培养基中,盖上透气膜。 置于摇床上，18、200- 250rpm速度摇约需35天，使OD600=（对数生长期或对数生长前期）时开始制备。 取出TB缓冲液及无菌的50ml离心管置于4冰浴中，预冷低温高速离心机（4、2500rpm、10min）。 在50ml的离心管中加入约35ml-45ml的菌液，在4中冰浴10min。 取出后放置于离心机上离心4、2500rpm、10min。弃上清

6、液，在灭过菌的吸水纸上扣干（可重复多次收集菌体），先用约515ml的TB缓冲液重悬，再加至35ml的量（在冰上操作）冰浴10min。 重复+的步骤一次。 在35ml的TB缓冲液重悬后缓慢加入终浓度为7%的DMSO，混匀后在冰上冰浴10min。 分装成100-150ul/管（的EP管）浸入液氮中速冻，分装约300多管后转移放置于-80冰箱保存。4）转化效率的评估： 采用小量质粒快转（冰浴10min42热休克90s冰浴2min加无抗性LB液体培养基200ul37摇床复温培养30min）。 涂Kn、AP抗性板并做阴性对照（采用ddH20代替鉴定用的大提标准质粒），可以评价出是否有染菌、突变、转化效率

7、。 可以用Er2566等感受态做平行对照，评估其的生长快慢情况及转化效率的高低。转化效率=转化子总数/质粒DNA加入量（1ug/ul）,标准质粒为大提用的N31-EGFP。5）注意事项： 严格按照标准操作步骤，整个操作过程要注意温度（4冰上操作）且洁净的超净台环境防止污染。直接从-80取出的菌株培养致敏后比连续使用或4短期保存的细菌的转化率要高，一般是受体菌应处于对数生长期或生长前期即OD600=。转化鉴定时，42准确热休克90s不要振荡，迅速置于冰上2min,按照标准操作步骤进行评估。一般是感受态制备好在-80冰箱冻存2天后再做鉴定，更准确评估。质粒分子量的大小对转化效率也有影响，一般来说，

8、随着质粒分子量的增大，其转化效率会相应地降低。但当质粒在时，所得的转化率基本一致。7、电转感受态制备：1）准备工作：（提前一天）1、250ml LB液体盛于1L三角瓶中；2、1L超纯水；500mL离心管两支；10%甘油400mL；3、离心管和200ul枪头若干以上物品，120灭菌20分钟后 置于4保存备用4、电转杯经纯水洗净后这置于75%乙醇浸泡5、挑ER2738菌单克隆，接种于4mlTet抗性的LB中，于37 190rpm过夜振荡培养。2）感受态制备：1、取前一夜扩增的菌液3ml接种于 250mlTet抗性LB中，37 240rpm振荡培养，约2-3小时OD值可达(其间每1小时测一次OD，其

9、值在之间均可，但在时效率最好)；2、将菌液置于冰水混合物中冷浴30分钟。同时将前一夜置于4保存的物品取出，置于冰水混合物中冷浴30分钟，同时将离心机预冷到4；3、将菌液全部转入500ml离心管中，2500rpm，4离心10分钟；4、弃上清，向离心管中加入约100ml预冷的无菌水，在冰水混合物中摇晃瓶身，使沉淀充分悬起，然后再补加200ml无菌水，与离心机中4000rpm，4 下离心10分钟；5、重复步骤4两次；6、以10%甘油代替无菌水重复步骤4一次；在离心的过程中将离心管插入冰中预冷；7、充分弃上清，加入200ul10%甘油，要换瓶身，使沉淀充分悬起，用预冷的枪头按100ul/支分装细胞于离

10、心管中；8、将分装好的细胞放入-80保存。3）质量控制：将电转杯从乙醇中取出，置于超净台中，用无菌风吹4小时从-80取出一支感受态，立即放入冰盒里；取1ul标准质粒（1ug/ml）加入感受态中，混匀后，加入预冷的电转杯中；将电转条件设为，电击2-3秒，立即加入1mlSOC培养基并混匀；将混合物转入离心管中于37，200rpm振荡恢复半小时；用LB将培养物稀释至103涂于Amp固体培养基上，倒置于37温箱中，过夜培养。计算效率：效率=菌落数103103。二、DNA操作系统1、溶液 I:葡萄糖50mmol/L，EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 25mmol/L，。2、溶液 II:NaO

11、H L，SDS 1%，用ddH2O现配现用。3、溶液 :取5mol/L NaAc 60mL，冰乙酸，混合后加ddH2O至100mL。4、酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)以25：24：1的比例混匀平衡酚、氯仿、异戊醇，保存于棕色玻璃瓶中，上覆一层Tris-Cl水相，4储存备用。5、TE缓冲液:10mmol/L Tris-Cl ，1mmol/L EDTA ，灭菌后使用。实验室中配有100的TE母液，用时可用ddH2O稀释成1使用液，灭菌后使用。6、L CaCl2:在适量纯水中溶解54g ，定容至100mL，高压除菌后保存于4备用。7、10DNA上样buffer：母液：以500ml为例： 蔗糖：2

12、00g，溴酚蓝：， 取去离子水定容至500ml，完全溶解后放置于4保存。*该母液配制完正常颜色为棕红色，颜色与pH值有关；存储时间较长，每次使用时需摇匀，并注意是否长菌。染料：SYBER Green I（Molecular Probe）10,000每次取50ul染料加入50ml母液中，充分摇匀。分装于避光管中，即为10DNA上样buffer，配制好的buffer均需避光4保存。*配制者需督促使用者及时将避光管放回4，并经常检查溶液存量，染料需提前订购。8、RNase A（DNase free）：RNase A干粉（Ameresco）溶解于L的CH3COONa（pH ）中，使终浓度为1mg/ml

13、，加热至100，15min，室温冷却。用体积的1M Tris-Cl调pH至后，分装，于-20冻存。*500ul/管分装，供分子克隆实验使用；3ml/管分装，供大提质粒使用。RNase A干粉需提前订购，及时检查使用情况。三、蛋白质操作系统（一）、电泳1、30%丙烯酰胺将29g丙烯酰胺和1g N，N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，于磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。补加水至终体积为100ml。以m孔径过滤溶液，去除不溶性杂质。查证该溶液的pH值应不大于，置棕色瓶中保存于室温。注意事项：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具

14、。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。2、 Tris-HCl 400ml 水中溶解Tris-Base , 浓盐酸调PH至后定容至500ml3、 Tris-HCI400ml 水中溶解Tris-Base , 浓盐酸调PH至后定容至500ml4、10%SDS900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68助溶，加入几滴浓盐酸调节pH值至，加水定容至1L，分装备用。5、10过硫酸铵称取过硫酸铵2g，适量水溶解后，定容至20mL，分装成1mL/管，于-20保存备用。6、蛋白上样Buffer（6蛋白加样缓冲液）称取十二烷基硫酸钠12g、溴酚蓝，1M Tris-Cl (

15、pH= 30ml、甘油60ml、巯基乙醇5ml，定容至100ml。7、蛋白质电泳buffer（5）称取三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸钠, 在水中溶解并定容至1L。（二） 染色1、染色液（考马斯亮蓝染液）甲醇45，冰乙酸10，去离子水45，加考马斯亮蓝R-250或G-250至%，过滤后使用。 2、10脱色液称取KCl ，加水定容至1L3、蛋白快速银染所需溶液（1）固定液：400mL 甲醇，500uL甲醛，加水定容至1L；（2）20% AgNO3溶液：20g AgNO3加水定容至100mL；（3）Na2S2O3溶液: Na2S2O33H2O,加水定容至1L；（4）显色液（未加甲醛）：30g

16、 NaCO3,20mL 上述Na2S2O3溶液，加水定容至1L，（临用前加入甲醛，甲醛量如何确定）。（5）柠檬酸： C6H8O73H2O,加水定容至1 L。（三） 杂交1、电转液：称取TrisBase ，甘氨酸，先加4L水溶解，再加甲醇1200ml, 定容至6L。2、10TN：称取NaCl , Tris , 加入浓盐酸调节至PH ，定容至5L 。 3、封闭液（WB用）： 称取5g 脱脂奶粉，加入TN，定容至100ml。4、TNT：TN中加 Tween-20至%。5、AP底物：氯化钠， ，TrisBase ，加水溶解，加浓盐酸320ul调节pH至, 定容至500ml注意事项：NBT、BCIP、N

17、-N-二甲基甲酰胺为有毒试剂，戴乳胶手套在通风橱中操作。配制用的EP管最好采用新管子，防止漏液，用后的空管注明有毒，用PE手套或是塑料袋包好再丢弃。6、NBT配制：500mg NBT粉末溶于7ml N-N-二甲基甲酰胺，3ml 去离子水中，颠倒混匀，溶解即可。7、BCIP配制：100mg BCIP粉末溶于10ml N-N-二甲基甲酰胺中，颠倒混匀，溶解即可。（四） 纯化1、10裂解液：50mmol/LTris-HCl（），10mmol/LEDTA，300mmol/LNaCl.。2、Buffer I：20mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTA，100mM NaCl。3、8M Ure

18、a：称取480g的尿素，用Buffer I定容至1升即可。四、细胞培养相关（一）胰酶的配制：（浓度为1 ，1L）1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。2、称取牛胰蛋白酶；EDTA 2 g；3、用超纯水溶解；4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；5、超纯水定容至1L；6、不锈钢滤器加滤纸两张高温灭菌后，在超净工作台过滤；7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染菌，其余置于4待用；8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。（二）DMEM配制：1、所需试剂及材料：试剂： DMEM干粉（GIBCO 10L）、超纯水（Milli-Q）、

19、Na2CO3 （Sigma）材料：10L玻璃瓶、 500ml盐水瓶（灭菌）、 滤膜、 滤器（事先放好两层滤膜并高压灭菌）、磁力搅拌器 大号搅拌子 蠕动泵 胶塞2、操作步骤：(1)10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。(2)在10L玻璃瓶中加入超纯水，将DMEM干粉倒入，在磁力搅拌器上搅拌溶解。(3)按照L 加入Na2CO3 。(4)调节pH值至。(5)过滤分装，并注明名称及配制日期。此过程注意无菌操作！(6)最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。(7)清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。（三） 1640、MEM培养基的配制同上， Na2C

20、O3的用量见包装说明（四）细胞间100双抗（青霉素、链霉素）的配制青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。配制的步骤以400ml为例：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。2.准备5瓶青霉素（80万单位/瓶）、4瓶链霉素（100万单位/瓶）。3.加入1-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子内，浸泡后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器内。用PBS再次润洗装有青霉素及链霉素的小瓶子，将残留的青霉素及链霉素溶解，将液体并入配制容器内，重复润洗2次。4.用细胞间专用PBS定容至400ml，搅拌均匀。5.将配制的母液用的滤膜过滤除菌，分装到灭菌后的4m

21、l EP管内，2ml/ 管,冻存于-20。( 4mlEP管需提前一天灭菌，烘干过夜。)（五）100 L-谷氨酰胺配制（浓度200mM= L ）所需试剂及材料：L-谷氨酰胺干粉（Sigma）、 超纯水（Mili-Q）、 1L烧杯、量筒、4ml EP管（灭菌）。步骤：1认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。2称取相应质量的L-谷氨酰胺干粉，用超纯水溶解后，小滤器过滤除菌。按需要分装（如2ml/管） -20保存。注：勿高压灭菌，过滤后，尽快分装，切勿放在4过久！（六）100 丙酮酸钠配制 （浓度100mM 11g/L）所需试剂及材料：丙酮酸钠（Sigma） 超纯水（Mili-

22、Q） 1L烧杯，量筒， EP管（灭菌）步骤：1认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍2称取相应质量的丙酮酸钠干粉，用超纯水溶解后，小滤器过滤除菌。按需要分装（如1ml/管） -20保存。注：勿高压灭菌 过滤后，尽快分装，切勿放在4过久！（七）Verson配制1.洗净容器：自来水10遍，去离子水5遍，超纯水3遍。2.配制Verson（超纯水配制）：Verson (1)(g/L)KClKH2PO4NaClNaHCO3Na2HPO412H20EDTA3.分装到500ml盐水瓶，盖上胶塞（不用灭菌，煮过即可），插上针头（10mL以下的注射器针头），包上铝箔纸。4.120，20mi

23、n高压湿热灭菌，灭菌后，摆放至细胞间指定位置。（八）细胞间PBS配液 PBS 缓冲液配方：【1L体系】NaCl g，KCl g，Na2HPO412H2O g，KH2PO4 g调整pH 至具体步骤：1. 清洗配液瓶,自来水10遍，去离子水5遍，超纯水3遍。（一般使用细胞间配液瓶10 L 体系）；2. 按上述配方准确称量物品，倒入配液瓶（注意：若药品潮解，应更换）；3. 加入超纯水（细胞间配液用，R206），定容至准确体系，溶解完全；4. 使用细胞间pH计，调配pH至；5. 使用细胞间灭菌过的500mL 盐水瓶进行分装，标记，加橡胶塞针头，120，20min高压湿热灭菌；6. 灭菌完，摆放至细胞间

24、相应位置。（九）磷酸钙转染试剂配制试剂前，认真清洗配制容器，自来水10遍，去离子水5遍，超纯水3遍。CaCl2 M （500ml） (MW 147) SigmaUltra C5080 g 溶解于500ml超纯水，小滤器过滤除菌。50ml样品管分装后，冻存于-20C 。HeBS 2x （1000ml）NaCl (MW SigmaUltra S7653 g M final) HEPES (MW SigmaUltra H7523 g final) Na2HPO4, anhydrous (MW 142) SigmaUltra S7907 g mM final) 800 ml超纯水溶解后，用1Mol N

25、aOH溶液调PH值至，然后定容至1000ml。（准确的PH值对转染效率非常重要，请用细胞间内的精密PH计测量PH值，测量前要校正PH计，线型要在99101）小滤器过滤除菌。50ml样品管分装后，冻存于-20C 。（十）酸液配制（1L）：重铬酸钾 120g浓硫酸 200ml去离子水补至 1000ml具体步骤：1 在通风橱中架好塑料桶和搅拌器，确保稳定，不会侧翻。2 在塑料桶中10L、15L、20L的位置划好刻度线，以利于后续步骤的定容。3 在塑料桶中加入半桶去离子水，开动磁力搅拌器，缓慢倒入浓硫酸（硫酸遇水放热，倒太快会导致液体飞溅）。4 缓慢倒入重铬酸钾，定容后，搅拌至完全溶解。注意事项：废酸

26、液应先用工业级的NaOH中和后方可倒往下水道，否则会腐蚀水管、污染环境，中和过程中会大量放热。五、单克隆抗体制备系统1、PRMI 1640HT培养基（10L）:PRMI 1640干粉10包（10L），称取丙酮酸钠（Sodium Pyruvate，S）10L，适量ddH2O溶解后加入。称取黄嘌呤(hypoxanthn，H) 10L胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）10L +谷氨酰胺（L-Glutamine,L-Glu）10L，置适量ddH2O 中在4550条件下溶解后加入。加ddH2O至10L，补加NaHCO3 20g/10L。用1mol/L HCl调节pH至(经验值是3ml/10L)。过滤

27、除菌。取少量的培养液置培养瓶中并放入 CO2培养箱中，一周后，如培养中未长菌，同一期配制的基础培养液方可使用。2、PRMI 1640培养基:PRMI 1640HT培养基配制时不加H（黄嘌呤）和T （胸腺嘧啶核苷）即可。3、过氧乙酸： 100ml的H2O2加入到200ml的乙酸中，再加入6ml浓H2SO4，放置过夜即可。4、细胞冻存液： 90mL胎牛血清10mL DMSO（二甲亚砜）,4冻存。 EIA系统六、EIA系统（一）常用溶液: 1、20(1L)：Na2CO3 ；NaHCO3 2、10(1L)：Na2HPO47H2O ；NaH2PO4 3、2ED：1XPBS+%酪蛋白+2%明胶+%防腐剂（

28、proclin-300）（二）基本操作：1、标本的采取和保存大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。2 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。从冰箱中取出的试验用试剂应

29、待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 3 加样 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。需稀释的样品可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。若每孔所加样品不同,每板的加样时间不宜超过7分钟,另一方面要注意不要造成孔间污染；加酶结合物和底物时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 4 保温 常见的ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保

30、温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。保温的方式本实验室为恒温箱中温育,为避免蒸发，板上应用封板膜覆盖板孔.反应板不宜叠放，板间要有一定的空间以保证各板的温度都能迅速平衡，另外，尽量不要将板紧贴恒温箱的侧壁，因侧壁的温度通常较高。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。 5 洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗板前要检查洗瓶中洗液是否够用,废液瓶中的废液是否超过警戒线,洗头的出液口与吸液口是否有堵塞,洗瓶、废液瓶、缓冲瓶瓶口是否旋紧，洗板程序是否正确。除包被后的洗板，一般洗板次数为5次，通常第一次洗板时不要离开，注意观察是否有异常，若没问