杀菌率试验规程.docx

1、杀菌率试验规程杀菌率试验规程TSB营养肉汤配置5X108cfu/ml。用无菌蹑子夹住已灭菌 10mm* 10mm滤纸一角，一面朝上，注入10ul菌悬液，放到无菌平 板内，37C温箱中干燥20min-30min ,（或在室温自然阴干后使 用）制成菌片。每个菌片回收菌落，按活菌培养计数所得结果， 应为5X105 GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准或 188X10 2002消毒技术规范（4）、取杀菌试验用无菌大试 管，先加入0、5ml试验用菌悬液，再加入0、5ml有机干扰物 质，混匀，置20lC5min ,用无菌吸管吸取步骤1中的试验样 液4、0ml注入其中，立即开启计时器，并迅速混

2、匀（在 手 掌上振摇80次）。-见消毒技术规范或吸取试验用菌悬液 0. 1ml ,加入到含5ml样液的试管中，立即开启计时器，并迅 速混匀（在手掌上振摇80次）。全文结束（5）、作用2min 5min lOmin、20min,即刻用 无菌吸管吸取0、5ml移入鉴定合格的4、5ml中和剂溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验 结果规定的相同）充分混匀，中和作用lOmin后，取样液、10倍 系列稀释液0、5ml （见GB15979-2002）或分别吸取1、0 ml （-见消毒技术规范）（见图四），置于2个 灭菌平皿，用凉至40459营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml作倾注，转动平皿，

3、使其充分均匀，琼脂凝固 后翻转平板，35C2C培养48h （细菌）或（酵母菌）25C2C 培养72h,作活菌菌落计数。、同时用稀释液代替样液进行平 行试验，作为阳性对照管。（7）、阴性对照组：分别吸取试验用相 关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。（8）、计数菌落时，一 般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu 300cfu的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎 上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符 合合乎上述标准，则以该合格的2个平板菌落的平均值作为结 果。、试验重复3次，求其平均值。根据各组活菌浓度（cfu/ml ）,计算杀菌率，见计算公式1。或

4、根据各组活菌浓度 换算为对数值（N），计算杀灭对数值，见计算公式2。3、2载体法杀菌试验操作程序、试验样品用无菌标准硬水（过滤除菌）稀释至规定浓度，制成（稀释液）试验样液。（2）、 吸取样液5、Oml放入灭菌平皿，另吸取PBS5、0ml注入平皿中，作为阳性对照皿。每皿用无菌镶子 夹 住菌片一角放入试样皿和阳性对照皿。（3）、作用至设定时间后， 即刻用无菌镶子夹住菌片一角，投入含5、0ml中和剂的试管中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试 验结果规定的相同）充分混匀计时。（见图三）（4）、中和lOmin后，取样液或10倍系列稀释液1、Oml （见图四），置于两个灭菌平皿，接种凉至40 459营养琼脂培

5、养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml,转动平 皿10-20下，使其充分均匀，凝固后，于35C2C培养48h（细菌）或72h （酵母菌），作活菌菌落计数。（5）、试验重复3 次，求其平均值。（6）、阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和 培养基进行培养，观察有无污染。A、 PBC液（0、03mol/L磷酸盐缓冲液）、B、 无菌标准硬水lml置于灭菌平皿内、C、 空白平皿，倾注营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培 养基（酵母菌）15ml培养。（7）、计数菌落时，一般以肉眼观察， 必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu300cfu的平板为准， 每个稀释度3个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该3

6、个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合合乎上述标准，则 以该合格的2个平板菌落的平均值作为结果。4、计算公式1、杀菌率 Xl= （ A B） / AX 100% 式中：X19X104cfu/ml ） 45X107cfu/ml ) 2002消毒技术规范(试验菌悬液在1X10一、定义和术语cfu/ml ）中和剂 中和剂加杀菌剂（样品）二9： 1,作用lOmin配 置而成。二、 中和剂鉴定试验原理中和剂鉴定试验原理试验分组第1 组杀菌剂+菌液f培养第2组（杀菌剂+菌液）+中和剂第 3组中和剂+菌液一培养第4组（杀菌剂+中和剂）+菌液 第5组阳性菌数对照第6组阴性对照。一培养一培养观察杀菌剂 对观察

7、残留杀菌观察中和剂是观察中和产阳性对照组。阴性对照 组。试验菌有无杀剂被中和后，否抑菌。物，或未被完灭或抑制 能力受到杀菌剂作全中和的残留试验目的用后的试验菌杀菌剂对 试验是否能恢复生菌的生长繁殖长。是否有影响。三、 中和剂鉴定试验中易出现的问题及解决方法出现的问题 解决方法1、组无菌生长或组平板上少于5个菌落，其它 组正常。降低消毒剂浓度或缩短作用时间。2菌落数较多且数量基本相 同，其它组正常。提高消毒剂浓度或延长作用时间。3组中和剂菌落数明显少于PBS组菌数降低中和剂浓度或改变中和剂成分。4组（中和产 物）菌落数明显少于PBS组菌数，其它组正常。提高中和剂浓度或改变中和剂成分。5多次更换中

8、和剂均不能得到 满意结果。选用载体法进行中和剂鉴定，杀菌试验同时用载体法 进行。四、1鉴定试验操作程序中和剂悬液定量鉴定试验操作程序- 消毒技术规范试验分组第1组第2组第3组第4组第5组 第6组取试验样品4、Oml加入各对应组4、5ml中和剂加入对应组4、9ml中和产物b加入对应组4、5mlPBS+ 0、4ml硬水混匀振敲80次，混匀作用至试验预定时间，取0、5ml加入下列对应组作用lOmin,4、5ml振敲80次、混匀/作用10min/5X107备注b中和产物的配置：先将试验样液1、Oml与中和剂溶液9ml混合，作用lOmin后制成四、2鉴定试验操作程序中和剂鉴定试验操作程序-载体法试验分组

9、用无菌蹑子取菌片加 入下列第1组吸取试验样品5、Oml第2组吸取试验样品5、0ml于无菌平第3组吸取中和剂5、0ml于无菌第4组吸取中和产物5、0ml于第5组吸取PBS5、0ml于无菌第6组5、0ml作用lOmin作用lOmin/取原液或稀释用稀释液用稀释液10倍用中和剂10用中和产物用稀释液10稀释液+液K Oml接种平板（2个/样10倍系列稀释系列稀释倍系列 稀释10倍系列稀释倍系列稀释中和剂各h 0ml本）接种平板操作要点即刻混匀，并按规定时间接种培养基中和剂鉴定评价第1组不第2组有且较第3、4、5组菌数相似，且其误差率W15%第6组无评价规定长菌或明显少于第2组1组为多，较第 3、4、

10、5组为少的菌数生长，并三组间平均菌数二（第3+4+5组菌数）4-3；菌生长中和剂鉴定合格标准中对1、2组菌数要求。符合下表要求。05X (1-10 ) (X + 5)Y(10)1、5 Y误差率二（三组平均菌数GB15979） cfu/ml ）备注消毒技术规范 用PBS （试验菌悬液在1 X107液，分别加入各组对应组剂加入 对应组和产物b加入对应组（稀释液）加入对应组振敲80次， 混匀作用至试验预定时间，取0、5ml加入下列对应组作用lOmin,4、5ml振敲80次、混匀/ 作用 10min/5X106cfu/片-GB/T15979) cfu/片一消毒技术规范)吸取样品稀释液5ml吸取PBS5ml作为阳性对照管放入一菌片放入一菌片作用至设 定时间后，即刻用无菌镶子夹住菌片，投入各含5、Oml中和剂的对应管中。