基础生化实验内容版.docx

1、基础生化实验内容版 实验一、考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白质含量【实验目的】学习、掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。【实验原理】考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。染料的最大吸收从465nm变为595nm，蛋白质染料复合物在595nm具有很大的光吸收值， 蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。 本方法操作简便快捷，灵敏度高，测定范围1-1000ug。【实验材料、仪器及试剂】1材料：新鲜的植物材料2仪器：722分光光度计，天平，离心机， 研钵，容量瓶，试管，移液管，漏斗（1）标准牛血清蛋白质溶液：0.1mg/ml （2）考马斯亮蓝

2、G-250溶液： 【实验步骤】1样品的提取：准确称取鲜样2克，用2ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到25ml容量瓶中并定容。在8000rpm冷冻离心10min，取上清液待测。2 标准曲线的绘制：取8支具塞试管，按表1加入试剂。表1-1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表试剂管号12345678标准蛋白质溶液（ml）00.20.40.60.81.000样品提取液（ml）0000000.20.2蒸馏水量（ml）1.00.80.60.40.200.80.8G-250试剂（ml）55555555蛋白质含量（ug）020406080100xx595nm吸光值将上面8支试管摇匀， 放置5分钟后，用1cm光

3、径比色杯在595nm下比色，记录吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 根据样品吸光值在标准曲线查得蛋白质含量。 【结果计算】C VT样品中蛋白质含量（ug/g.FW） VSWF1000式中： C为查标准曲线值（ug）； VT为提取液总体积（ml）；VS为测定时加样量（ml）； WF为样品鲜重（g）。实验二 植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA） 免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunoso

4、rbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式，一种是在固相载体上包被抗体（直接法），另一种是包被抗原（间接法）。直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素蛋白质复合物。根据质量作用

5、定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H量的多少。材料、试剂及设备1 材料 各种新鲜植物材料2 仪器设备 研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10l，40l,200l,1000l），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。 3 试剂 (1) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 12H2O，用量

6、筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。(2) 样品稀释液：500 ml PBS中加0.5 ml Tween-20，0.5g明胶（稍加热溶解）。(3) 底物缓冲液：称取5.10g C6H8O7H2O（柠檬酸）， 18.43g Na2HPO412H2O，用量筒加1 000ml蒸馏水，再加1 ml Tween-20，pH为5.0。(4) 洗涤液：1000ml PBS加1mlTween-20。(5) 终止液：2mol/L H2SO4。（6）提取液：80甲醇，内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，再配成80%的浓度)。操作步骤1样品中激素的提取（1） 称取0

7、.5-1.0g新鲜植物材料（若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻半小时后，保存在-20的冰箱中），加2ml样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml试管，再用2ml提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4冰箱中。（2） 4下提取4h，3500转/min离心8min, 取上清液。沉淀中加1ml提取液，搅匀，置4下再提取1h，离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。（3） 上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是： 80%甲醇（1ml）平衡柱上样收集样品移开样品后用100%甲醇（5ml）洗柱100%乙醚（5ml）洗柱100%甲醇（5ml）洗柱循环。（4） 将过柱后的样品转入5ml塑料

8、离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样品稀释液定容（一般1g鲜重用2ml左右样品稀释液定容，测定不同激素时还要稀释适当的倍数再加样）。2样品测定（本指南所用的量是按一块96孔板计算的）竞争：即加标准物、待测样和抗体。 加标样及待测样： 取适量所给标样用样品稀释液配成：IAA，ABA， ZR标准曲线的最大浓度为100ng/ml,GA的最大浓度为50ng/ml，JA-ME 的最大浓度为200ng/ml。然后再依次2倍稀释8个浓度（包括0ng/ml ）。将系列标准样加入96孔酶标板的前两行，每个浓度加2孔，每孔50l,其余孔加待测样，每个样品重复两孔，每孔50l。 加抗体：在5

9、ml样品稀释液中加入一定量的抗体（最适稀释倍数见试剂盒标签,如稀释倍数是1：2000，就要加2.5l的抗体）,混匀后每孔加50l，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。 竞争条件37左右0.5h。洗板：将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第二次。共洗涤四次。加二抗：将适当的酶标二抗加入10ml样品稀释液中（比如稀释倍数1:1000就加10l），混匀后，在酶标板每孔加100l，然后将其放入湿盒内，置37下，温育0.5h。洗板：方法同竞争之后的洗板。加底物显色：称取10-20mg邻苯二胺（OPD）溶于10ml底物缓冲液中（小心勿用手接触OPD），完全溶解后加4l 30%

10、 H202混匀（显色液要现用现配），在每孔中加100l，然后放入湿盒内，当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加入50l 2mol/L硫酸终止反应。比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。 结果计算： 用于ELISA结果计算最方便的是logit曲线。曲线的横坐标用激素标样各浓度（ng/ml）的自然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。Logit值的计算方法如下： B/B0 B Logit（B/B0）=ln =ln 1-B/B0 B0-B 其中B0是0ng/ml孔的显色值，B是其它浓度的显色值。 待测样

11、品可根据其显色值的logit值从图上查出其所含激素浓度（ng/ml）的自然对数，再经过反对数即可知其激素的浓度（ng/ml）。求得样品中激素的浓度后，再计算样品中激素的含量（ng/gfw）。实验三 酶的特异性、温度、pH对酶活性的影响 （一）酶的特异性【实验原理】 酶具有高度的特异性，一种酶只能催化一种化合物或某一类化合物，如淀粉酶，只能催化淀粉水解，而不能使蔗糖水解。本实验以唾液淀粉酶分别对淀粉及蔗糖的不同作用，来说明酶的特异性。【实验试剂】1唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。20.3%NaCl的0.5%淀粉液30.5%蔗糖液4Ben

12、edict试剂A、取CuSO417.3g溶于100mL热蒸馏水中，冷后稀释至150mL；B、取柠檬酸钠173g及Na2CO3（无水）100g，加水600mL加热使之溶解，冷后稀释至850mL；C、将A液缓慢注入B液中，混匀备用。（可长期保存）。【实验步骤】1取试管两支，一支加入0.5%淀粉液2mL，另一支加入0.5%蔗糖液2mL；2于两支试管中各加入制备好的唾液1mL；3将两支试管同时放入37恒温水浴箱中保温；415分钟后，取出两试管，各加入Benedict试剂1mL；5将两试管同时放入沸水中煮沸6分钟；6取出两试管，观察记录颜色的变化，并注意有无红色沉淀产生，为什么？（二）温度对酶活性的影响

13、【实验原理】 酶促反应同一般化学反应一样都需要在一定的温度下进行，使酶促反应速度最大时的温度称为此酶的最适温度，低于此温度，酶促反应速度缓慢，高于最适温度，酶蛋白变性失活。本实验以入唾液淀粉酶在不同温度下分解淀粉为例，说明温度对酶活性的影响。【实验试剂】1唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。20.3%NaCl的0.5%淀粉液3KI-I溶液【实验步骤】1取三支试管并编号，同时各加入5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混匀；2将管1、管2、管3同时分别放入冰浴，37水浴，沸水浴中；315分钟后，取出各管，分别加入碘液数滴，观察并记录各管颜色变化，

14、并解释此现象。（三）pH对酶活性的影响【实验原理】在一定条件下，酶活性最高时的pH值称为最适pH，偏离此pH，酶活性就会有所下降，不同酶的最适pH不同。例如，胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5，胰蛋白酶的最适pH为8等。本实验以入唾液淀粉酶（最适pH6.8）在不同pH条件下水解淀粉为例，说明pH对酶活性的影响。【实验试剂】1唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1-2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。2pH1.5溶液：取0.2M Na2HPO42H2O溶液41.2mL加入0.1M柠檬酸38.8mL，然后用浓HCl调至pH1.5左右；2 pH6.8溶液：取0.2M Na2HPO42

15、H2O溶液61.8mL加入0.1M柠檬酸溶液18.2mL；3 pH9.8溶液：取0.2M Na2HPO42H2O溶液77.8mL加入0.1M柠檬酸溶液2.2mL，然后用0.1N NaOH调至pH9.8。【实验步骤】1取试管3支并编号，如下表加入各试剂；23支试管同时放入37恒温水浴箱内保温；315分钟后，取出3支试管，分别加入碘试剂数滴，每加1滴，注意摇匀，观察并记录颜色变化。试管号0.5%淀粉pH1.5溶液pH6.8溶液PH9.8溶液唾液12mL1mL001mL22mL01mL01mL32mL001mL1mL实验四 淀粉酶活性的测定【实验目的】本实验的目的在于掌握分别测定这两种淀粉酶的方法。

16、【实验原理】 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将3，5二硝基水杨酸还原生成3-氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。【实验材料、仪器和试剂】1实验材料： 萌发的小麦（芽长1厘米左右）2. 仪器：722分光光度计，天平，离心机，水浴锅，研钵，容量瓶，试管，移液管，三角瓶，漏斗3. 试剂：1淀粉溶液，0.4 N NaOH，PH5.6的柠檬酸缓冲液，3，5一二硝基水杨酸，麦芽糖标准液， 【操作步骤】1. 酶液的提取：称取2克萌发的小麦种子（芽长1厘米左右）,置研钵中

17、加一克石英砂，磨成匀浆倒入50毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，离心6000转/分钟，取上清液备用。2. a-及-淀粉酶总活性的测定：取上述酶液26毫升，放入容量瓶中，用蒸馏水稀释至100毫升（稀释程度视酶活性大小而定）。混合均匀后，取4支试管，2支为对照,2支为测定管，各加入稀释之酶液1毫升及1毫升Ph5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复a-淀粉酶测定的第（4）及（5）的操作，同样准备糖的测定。3. 酶促反应液的制备：取4只试管标号，按下表加入试剂: （反应时间要准确！）试剂（）管号酶液1111缓冲液1111aOH (0.4 M)440050 0C预保温10min(淀粉液同时保温)1%淀

18、粉液222250 0C准确保温5minaOH (0.4 M)00444. 标准麦芽糖及酶水解液中麦芽糖含量的测定；按下表加入试剂试剂 (ml)/管号1234567麦芽糖00.20.61.01.41.82.00.00.00.00.0蒸馏水2.01.81.41.00.60.20.0-酶解液-2.02.02.02.03，5二硝基水杨酸22222222222520nm吸光值将上表中试剂加完后，充分混匀，放入沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25毫升，用分光光度计在520um波长下进行比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线；将酶水解液测定的消光值在麦芽糖标准曲

19、线中查出麦芽糖含量，然后进行结果计算。 【结果与计算】 （a+）-淀粉酶总活性麦芽糖（毫克）/鲜重（克）/ 分钟 = （B-B） 样品稀释总体积 样品重（克）CB一(a+)-淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量B一(a+)-淀粉酶的对照管中麦芽糖量C一比色时所用样品液毫升数实验五 植物材料中维生素C含量的测定 （ 染料滴定法 ）【实验目的】本实验要求学生掌握染料滴定法测定维生素C的原理和方法 【实验原理】维生素C在体内是一种较强的还原剂，利用染料2，6-二氯酚靛酚作氧化剂，可将还原态的维生素C氧化成脱氢维生素C，而染料本身还原成无色的衍生物。 2，6-二氯酚靛酚在酸性条件下呈红色。在滴定终点之前，

20、滴下的2，6-二氯靛酚立即被还原成无色。当溶液从无色转变成微红色时，即为滴定终点。【实验材料、仪器和试剂】1 实验材料： 水果或蔬菜2 仪器：天平，微量滴定管 ，研钵，容量瓶，移液管，三角瓶，漏斗3试剂： （1）2%草酸 （2）0.001N2，6-二氯酚靛酚钠溶液 【操作步骤】1样品的处理和提取： 称取4.0克新鲜样品，置研钵中，加5毫升2%草酸，研成匀浆。通过漏斗将样品提取液转移到50毫升时瓶中。残渣再用2%草酸提取23次，提取液及残渣一并转入量瓶中最后以2%草酸定容。摇匀，过滤，滤液待测。2空白、样品的测定： 吸取滤液10毫升，放入50毫升三角瓶中，立即用2，6-二氯酚靛酚钠溶液滴定到出现

21、明显的粉红色在15秒内不消失为止。记录所用滴定液体积。（再重复二次）3测定： 取2%草酸10毫升，放入别一50毫升三角瓶内，用2，6-二氯酚靛酚钠滴定到终点，记录染料用量。（平行两份）【结果与计算】 （V1V2）KV X= 100 WV3 式中：X：100克样品所含维生素C毫克数（毫克/100克）W：称取样品重（克）V1：滴定样品所用染料毫升数V2：滴定空白所用染料毫升数V3：样品测定时所用滤液毫升数（即10毫升）V：样品提取液稀释之总体积（即50毫升）K：1毫升染料液所能氧化维生素C之毫克数，可由标定算出。实验六血红蛋白凝胶过滤层析【实验目的】通过本实验学习凝胶过滤层析的操作技术，掌握凝胶过

22、滤层析的原理及其应用。【实验原理】凝胶过滤（gel filtration）是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法，又称分子筛层析（molecularsieve chromatography）或排阻层析（exclusion chromatography）。1凝胶介质 目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4大类，即葡聚糖凝胶，商品名（ Sephardex）、琼脂糖凝胶，商品名（Sepharose）和聚丙烯酰胺凝胶，商品名（bio-gel ）和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。它们都是不溶于水的高聚物，内部有很微细的多孔网状结构。以Sephardex为例，它是由一定平均分子量的葡聚糖与环

23、氧氯丙烷交联生成的高聚物，网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯丙烷的用量来控制。葡聚糖的分子量越大、环氧氯丙烷用量越大，则交联度越大，凝胶的网眼越小。Sephadex有很强的亲水性，在水或缓冲液中能吸水膨胀。交联度越大，网眼越小，吸水量也越少。实际工作中常用每克干胶吸水量（mL）的10倍（G值）表示葡聚糖凝胶的交联度，可根据被分离物质分子的大小和工作目的，选择适合的凝胶型号。2凝胶过滤的原理凝胶过滤层析（凝胶过滤）是把样品加到充满凝胶颗粒的层析柱中，然后选择适当的缓冲液进行洗脱。 凝胶本身是一种分子筛，凝胶颗粒有一定得孔径，它可以把待分离样品按分子大小不同进行分离，好像过筛，可以把大颗粒与小颗粒

24、分开。但这种过筛与普通的筛子不同。凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使其充分吸收膨胀，然后装入层析柱中,加入欲分离的混合物,然后在用同一溶剂洗脱，在洗脱过程中颗粒直径接近和大于凝胶颗粒网孔直径的大分子，不能进入凝胶颗粒中的静止相，只能留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此先流出层析柱；反之，小分子则可自由出入凝胶颗粒，因而流速慢以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO2溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原

25、带时，褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。3凝胶过滤的优点及用途凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物；凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反应，因而溶质回收率接近100；而且设备简单、操作方便、分离效果好、重现性强，凝胶柱可反复使用。所以，凝胶过滤常用于测定相对分子质量 、脱盐、蛋白质等大分子的分离纯化 。 【实验仪器及试剂】1仪器： 层析柱（Lcm x 40cm）、真空泵、真空干燥器、抽滤瓶、恒温水浴2

26、试剂：（1）磷酸缓冲液（PH 7.0）：称取Na2HPO42H2O 2.172g，NaH2PO42H2O 1.076g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。（2）Na2HPO4EDTANa2溶液：称取 2.69g EDTANa2，3.56gNa2HPO42H2O，加蒸馏水溶解并定容至100mL。（3）40m mol/L FeSO4溶液:称取FeSO47H2O 1.11g溶于100mL水中（用时现配）。（4）Sephadex G2 5（5）固体铁氰化钾K3Fe（CN）6）（6）抗凝血【实验步骤】1凝胶溶胀：取10g SePhadex G25，加200mL蒸馏水充分溶胀（在室温下约需6小时或在沸水浴

27、中溶胀5小时）。待凝胶溶胀平衡后，用倾泻法除去细小颗粒，再加入与凝胶等体积的pH 7.0磷酸缓冲液，在真空干燥器中减压除气，准备装柱。2装柱：将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，在柱内加入少量磷酸缓冲液或直接把处理好的凝胶连同适当体积的缓冲液用玻棒搅匀，然后边搅拌边倒入层析柱中，同时开启螺旋夹，控制一定流速。最好连续装完凝胶，若分次装入，需用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面影响分离效果。装柱后形成的凝胶床至少长30cm，使胶床表面保持2-3cm液层。注意：整个操作过程中凝胶必须处于溶液中，不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层，应当重新装住。3平衡： 继续用磷酸缓冲液洗脱，调整缓冲液流速

28、，平衡20-30分钟。4样品制备：（1）取1m鸡的抗凝血放入小烧杯中，加5mL pH7.0的磷酸缓冲液，再加入27.5 mg K3Fe(CN)6 固体,用玻棒搅动使其溶解，即得褐色的高铁血红蛋白溶液。（2） 吸取 lmL FeSO4溶液和 lmL EDTA-Na2-NaHPO4溶液，于小烧杯中混匀。（注意：还原剂混合液要新鲜配制，尽可能缩短其与空气接触的时间）。5上样：旋开层析柱上端旋扭，待胶床上部的缓冲液几乎全部进入凝胶（即缓冲液液面与胶床平面相切）时，立即加入0.4mL上述混合液，待其进入胶床表面仅留约 lmm液层时，加入 0.5mL 缓冲液，再当胶床表面仅留约 lmm液层时，吸取0.5m

29、L血红蛋白样品溶液，小心地注入层析柱胶床面中央，注意切勿冲动胶床。慢慢打开螺旋夹，待大部分样品进入胶床、床面上仅有lmm液层时，用乳头滴管加入少量缓冲液，使剩余样品进入胶床，然后用液管小心加入35cm高的洗脱缓冲液。6洗脱：继续用磷酸缓冲液洗脱，调整流速，使上下流速同步保持每分钟约6滴。7凝胶的回收：实验完毕用洗脱液把柱内有色物质洗脱干净，保留凝胶柱重复使用或回收凝胶。【实验结果】（1）观察并记录实验现象。实验七 过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳【实验目的】（1）使学生掌握聚丙烯酸徽凝胶垂直板电泳的原理和操作技术；学会从植物材料（小麦幼苗）分离过氧化物酶同工酶。（2）根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，签定小麦幼苗过氧化物酶同功酶。【实验原理】同工酶是催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。同工酸与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，测定同工酶在理论上和实践上都具有重要的意义。本实验测定的过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与植物的光合、呼吸作用以及生长素的氧化等有关；在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定过氧化物酶的生物活性或其同工酶可以了解某一时期植物体内代谢的变化。1电泳带电粒子在电场中向与其自身带