SPAG6 and L1TD1 are transcriptionally regulated by DNA methylation in nonsmall cell lung cancers译.docx

1、SPAG6 and L1TD1 are transcriptionally regulated by DNA methylation in nonsmall cell lung cancers译SPAG6 and L1TD1 are transcriptionally regulated by DNA methylation in non-small cell lung cancers SPAG6和l1td1的非小细胞肺癌中DNA甲基化的转录调节摘要背景：DNA甲基化与其他表观遗传机制、基因转录活性共同调节，参与肺癌等恶性疾病的发病。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，各种抑癌基因已被称为肿瘤特异

2、性甲基化。然而，从大量的基因被鉴定为肿瘤特异性甲基化占绝大多数，肿瘤特异性甲基化至今不明。因此，本研究的主要目的是调查的详细机制（S）负责在NSCLCs的l1td1 SPAG6和基因转录调控。方法:我们分析了公开的RNA测序数据进行基因表达的分析检测。DNA甲基化分析的高分辨率熔体和亚硫酸氢钠基因组测序分析。此外，我们采用免疫组化的方法研究蛋白质的表达，细胞培养实验包括肿瘤细胞的生长、增殖、活力以及集落形成实验。此外，我们进行了异种移植实验中使用的免疫缺陷小鼠。结果:我们观察到在原发肿瘤mRNA表达下调l1td1 SPAG6和频繁（TU）样品相比，相应的非恶性肺组织（NL）非小细胞肺癌患者的样

3、本，我们进一步观察两基因的重新表达和下调SPAG6和l1td1 mRNA表达的大多数NSCLC细胞系表观遗传学积极药物治疗后。当我们分析检测NSCLC患者涂和相应的NL样品频繁的肿瘤特异性DNA甲基化和l1td1是SPAG6。ROC曲线分析表明，这两个基因的甲基化能够区分这些患者的TU和NL样本。免疫组化显示SPAG6 / l1td1甲基化和蛋白表达下调的基因关系密切。此外，通过功能分析，我们观察到了细胞的生长，对pcmv6-l1td1转染肺癌细胞增殖和存活率。此外，来自pcmv6-l1td1肿瘤体积减少相比，pcmv6进入转染NCI-H1975细胞株在裸鼠移植瘤模型。结论：总的来说，我们的研

4、究结果表明，l1td1 SPAG6和肿瘤特异的甲基化和DNA甲基化在NSCLCs参与了这些基因的转录调控。此外，在体外和体内实验显示肿瘤细胞生长抑制性非小细胞肺癌中l1td1。关键词：表观遗传学，DNA甲基化，非小细胞肺癌，SPAG6，l1td1背景DNA甲基化（简称甲基化）是一种重要的表观遗传修饰，调节基因的表达主要是通过结合甲基CpG结合蛋白（MBD）及其相关的染色质重塑因子DNA 1, 2 。研究表明，甲基化在各种分子和细胞过程中起着重要的作用，包括胚胎发育和基因组印记，以及恶性疾病的发病机制 3 - 7 。甲基化发生的共价键添加一个甲基胞嘧啶的5碳在CpG二核苷酸的DNA甲基转移酶催化

5、（Dnmts） 8, 9 。不同的遗传改变，可能通过抑制甲基化酶指标如5-脱氧胞苷逆转（5-AzadC）和5-氮胞苷（5-azaC）。再通过甲基化基因的表达通过DNMT抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂如曲古抑菌素A结合的协同效应（TSA）报道 10 。在非小细胞肺癌（NSCLC）多肿瘤抑制基因（抑癌基因）是已知的，频繁的甲基化。除了其他表观遗传学和遗传因子的甲基化可能是负责这些基因11-15转录失活。然而，从被确定是肿瘤全基因组的方法特异的甲基化500的绝大多数基因，肿瘤特异性甲基化是迄今未知的 12 。当我们还分析了公开可用的微阵列数据在原发肿瘤（TU）相比，非恶性肺组织（NL）非小细胞肺癌患

6、者的样本中，我们观察到肿瘤特异性表达下调这些基因16名 17 。一个广泛的PubMed搜索发现，许多这些基因的功能是没有固定在NSCLCs，在其他类型的癌症。基于这些观察，我们选择基因SPAG6（精子相关抗原6）和l1td1（LINE-1型运输问题域包含1）的详细investigation.spag6位于染色体区域10p12.2和被认为是一种癌睾丸抗原（CTA） 18 。CTAs代表一个大家族的肿瘤相关抗原这是在免疫组织如睾丸表达但也在各种来源包括肺癌 19 肿瘤组织中检测到。SPAG6也表示在正常肺组织有纤毛功能 20 相关。它编码一种微管相关蛋白，作为微管本身或结合微管形成细胞的细胞骨架（

7、www.pantherdb。org）。有越来越多的证据表明，CTA的表达可能参与了肿瘤的发生，但是，到目前为止还没有报道关于参与SPAG6在恶性疾病生物学或肿瘤细胞的侵袭性 21 。l1td1位于染色体区域1p31.3在频繁的杂合性缺失（LOH）在非小细胞肺癌 22 观察。该基因编码人类胚胎干细胞自我更新和肿瘤细胞增殖所需的干细胞特异性RNA结合蛋白 23 。由于机构（S）失活，SPAG6和l1td1，没有详细的研究及其在NSCLCs发病机制中的作用还不清楚到目前为止，我们有兴趣进一步研究这些基因。因此，我们决定基因的表达、甲基化和在各种非小细胞肺癌细胞株l1td1 SPAG6和重新表达阐明如

8、果甲基化与这些基因的转录失活有关。此外，我们研究了这些基因的肿瘤特异性甲基化在大量的非小细胞肺癌患者相比，这些数据以及与非小细胞肺癌患者的临床病理学基因表达数据的特点。我们也分析了在非小细胞肺癌患者的一个子集的基因蛋白表达与l1td1 SPAG6和甲基化结果比较。此外，潜在的肿瘤细胞生长抑制这些基因的特性进行了研究在体外研究，对l1td1，同时在体内成瘤实验。总的来说，我们发现甲基化作为一种机制在NSCLCs l1td1 SPAG6和转录活性的调节。此外，我们的研究结果表明，l1td1功能作为一种肿瘤细胞生长抑制因子在非小细胞肺癌。方法公开可用的数据库IlluminaHiSeq RNA测序（R

9、NA-Seq）从“癌症基因组阿特拉斯获得数据”（TCGA）数据库（http：/ / cancergenome。NIH。gov），癌症的浏览器（https:/genome-cancer.ucsc.edu）和cbioportal癌症基因组学（http:/www.cbioportal.org） 28 24。为单核苷酸变异（SNVs分析）和l1td1 SPAG6和肺腺癌缺失（luad）和肺鳞状细胞癌（lusc）使用数据集。分析患者的临床病理资料的总结是附加文件1所示：表S2。额外的mRNA表达分析，乳腺浸润性癌（BRCA），结肠和直肠腺癌（coadread），头颈部鳞状细胞癌（调整），肾透明细胞癌（K

10、IRC），肝细胞肝癌（lihc）和前列腺癌（PRAD）使用数据集（https：cancergenome。美国国立卫生研究院。”），SNV和和杂合缺失swasperformedusing Caleydo软件 29 纯数据可视化。肿瘤细胞株和组织标本非小细胞肺癌细胞株A549和nci-h1993从美国典型培养物保藏中心购买（ATCC），细胞HCC827，nci-h1650和nci-h1975被Walter Berger博士惠赠（癌症研究所，维也纳大学医学院，奥地利）。细胞保持和发展作为描述 11 。非小细胞肺癌和非肺癌细胞系详细描述在附加文件1提供：表一和表S4。正常人支气管上皮细胞（NHBECs

11、）均购自promocell丸。重新表达实验肿瘤细胞治疗与去甲基化剂5-azadC单独或结合5-azadC和HDAC抑制剂TSA的描述 30 。未处理的细胞作为对照组。此外，DNA的乳腺癌（MCF-7、MDA-MB-453、MDA-MB-468，MDA-MB-231，BT20），结肠癌（HCT-15、HT29），卵巢癌（SK-OV3，A2780），胰腺癌（AsPC-1、BxPC-3）以及头部和颈部肿瘤细胞株（CAL27，FaDu）是由维也纳大学医学院各成员提供，奥地利。原土和146 I-III期非小细胞肺癌患者行手术切除肿瘤相应的NL样品的收集和保存在液氮直到使用。97这些患者的临床病理特征包括

12、性别、年龄、组织学、肿瘤分期、淋巴结分期、病期、无病生存期（DFS）和总生存（OS）是可用的。此外，从这些患者中35的福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）涂和NL标本进行免疫组织化学。这项研究是由当地伦理委员会批准。甲基化敏感的高分辨率熔解分析（MS-HRM）从NHBECs基因组DNA，分离和检测试剂盒采用EPI亚硫酸氢钠亚硫酸氢钠处理改性为18的肿瘤细胞系和146例非小细胞肺癌患者的组织样本（QIAGEN） 11 。从Ensembl数据库中得到了l1td1 SPAG6和基因组序列（版本69）。引物设计使用甲基引物Express V1.0软件，并列出在额外的文件1：表S3。MS-HRM分析使用R

13、otor-Gene Q循环执行（QIAGEN） 31 。亚硫酸氢钠测序（BGS）亚硫酸氢钠处理基因组DNA扩增（PCR引物序列在附加文件1：上市表S3）。PCR产物序列也进行分析，克隆使用MS-HRM TOPO TA克隆测序试剂（Invitrogen）。每四细胞克隆进行测序，用M13引物。实时反转录PCR（RT-PCR）对总RNA是从nhbecs and from cell lines and reverse transcribed 5 NSCLC采用omniscript反转录试剂盒（Qiagen） 11 .expression of spag6 was determined用TaqMan基因

14、表达分析hs00542625 _ M1（spag6）和hs03929097 _ G1（GAPDH）在stepone循环（应用biosystems）and Expression of l1td1 was determined using qiagen S quantitectSYBR Green PCR试剂盒（引物序列见表1：额外的队列S3）。ct method was used to calculate the differences in基因表达 32 。免疫组织化学（IHC）组织芯片的1毫米和5芯msections FFPE涂和NL样品用于蛋白表达l1td1 SPAG6和分析。样品用兔多克

15、隆抗体染色（hpa038440 SPAG6 1:100，西格玛奥德里奇）和hpa028501（l1td1 1:100，Sigma Aldrich）。结果IHC评分无染色（）、弱阳性（/ +），中度染色（1 +）或强阳性（2 +），比较结果与甲基化患者涂无或弱染色均为阴性的患者，免疫组化”而涂呈中度或强染色为阳性免疫组化”报道 12 。细胞转染pcmv6 NCI-H1975细胞株转染入（ps100001，OriGene）和pcmv6-l1td1（rc219014，OriGene）表达载体，用脂质体LTX试剂（Invitrogen）。此外，亚克隆到GFP编码序列存在pcmv6入门载体构建了pCMV

16、6-GFP载体（引物序列见表1附加文件：S3）。稳定转染NCI-H1975细胞株通过G418选择治疗（Invitrogen）和转染效率，RT-PCR和Western印迹法分析 11 。免疫沉淀和免疫印迹（ip-wb）IP是用来充实l1td1蛋白与pcmv6-l1td1 NCI-H1975细胞株表达载体转染后。转染细胞裂解皮尔斯IP裂解缓冲液（含phosstop Thermo Scientific）和EDTA自由抑制剂（罗氏）。IP是使用l1td1抗体进行（hpa028501、Sigma Aldrich），正常兔IgG（# 2729，细胞信号）和蛋白A / G加琼脂糖珠（圣克鲁斯）。Wester

17、n blot分析如描述的 11行。细胞增殖实验xCELLigence实时细胞分析系统（RTCA）（罗氏）用于实时测量细胞增殖。稳定转染NCI-H1975细胞株接种组和细胞增殖进行 11 。细胞活性检测稳定转染NCI-H1975细胞株接种于96孔板组和蓝试剂孵育盒（盒）。用该酶标仪反复检测荧光（Berthold Technologies） 11 。克隆形成实验稳定转染NCI-H1975细胞株的选择后，细胞生长到不同的集落形成能力进行检测。在成像细胞用0.05%结晶紫染色。异种移植肿瘤模型所有动物实验都是根据奥地利联邦科学部、研究和经济部以及维也纳大学医学院动物伦理委员会的指导方针批准的。对异种移

18、植肿瘤模型的女性NSG jax（nod.cg-prkdc SCID IL2RG tm1wjl / SZJ）小鼠（NSG小鼠）是从查尔斯河实验室购买和收藏在维也纳大学医学院动物中心SPF条件下。金刚石5x105 NCI-H1975细胞株稳定转染l1td1表达载体或空白对照载体注射左4 17周龄小鼠右侧面NSG。定期检查动物的整体健康状况，并用数字卡尺测量肿瘤大小。使用标准的公式计算肿瘤体积（长宽）/ 2 33 。在实验结束时，处死小鼠，对颈部肿瘤进行快速冰冻切片，并进行RT-PCR分析。统计分析Wilcoxon秩和检验和ROC（ROC）曲线进行分析，以确定甲基化差异图和NL样本MS-HRM分析。

19、调查确定甲基化和表达数据之间的相关性是Spearman相关。计算移植瘤体积之间的统计差异，进行双向方差分析检验。这些分析是采用GraphPad Prism 6软件以双侧P值0.05为有统计学意义的表现。MS-HRM数据与非小细胞肺癌临床病理特征的比较。Chi2试验/应用Fisher精确检验和t检验计算组之间的差异被用来计算之间的差异意味着。甲基化分析计算TN比值，以1.5的比值作为切断，将样品视为甲基化。患者的生存分析采用Log-rank检验进行。采用Cox回归对总生存率进行单因素分析，并用95%可信区间计算危险比率。P值小于0.05被认为有统计学意义。分析使用统计软件PASW进行（18版），

20、Kaplan Meier图用Kaplan Meier机 34 产生。“低”和“高”SPAG6以及l1td1 mRNA表达的临界值，自动定义公里绘图软件。结果SPAG6和对NSCLCs和其他实体瘤l1td1 mRNA表达下调 我们分析了公开的RNA-Seq数据从TCGA数据库探讨SPAG6和非小细胞肺癌患者l1td1 mRNA的表达。通过RNA序列表达式的值比较图和相应的luad和lusc NL样本数据集，我们观察到有统计学意义的下调肺腺癌l1td1 SPAG6和mRNA的表达（P0.0001，分别；图1A以及在肺鳞状细胞癌（P0.0001，分别；图1b。Inaddition，也在其他组织肿瘤从

21、TCGA数据库 24不同数据集的使用这些基因的表达weanalysedmrna 。相比于非恶性组织中我们观察到统计上的显着下调乳腺癌SPAG6（P = 0.0039），结肠癌（P0.0001，头颈部癌（P = 0.0030），肾透明细胞癌（P0.0001和肝细胞癌（P = 0.0046），但不是在前列腺癌（附加文件2：图S1）。相反，l1td1表达显著下调乳腺癌（P = 0.0253），结肠癌（P = 0.0224）和前列腺癌（P0.0001，但不是在头颈部癌、肾透明细胞癌和肝细胞癌（附加文件2：图S1）。在癌细胞的转录沉默SPAG6和l1td1由SPAG6和l1td1甲基化引起的 我们还确定

22、非小细胞肺癌细胞中这些基因的mRNA的表达以及在NHBECs。而SPAG6和l1td1 mRNA的表达在NHBECs随处可见，这些基因的表达，细胞中的所有5个非小细胞肺癌细胞株进行降低（图2A和d）。为了调查是否下调SPAG6和非小细胞肺癌中l1td1表达可能引起的甲基化，我们开发了MS-HRM检测分析5- promoterregionsofthese genes.spag6和l1td1被发现在所有5个非小细胞肺癌细胞株细胞的甲基化甲基化，但不在NHBECs（图2A和D）。 此外，我们对发现的5例非小细胞肺癌细胞系细胞是l1td1 SPAG6和甲基化与5-azadC单独和结合5-azadC和T

23、SA。我们观察到SPAG6上调以及l1td1 mRNA的表达与表观活性药物未经处理的细胞相比，RT-PCR检测处理后（图2b和E）。确认由MS-HRM分析获得的数据，我们还进行了亚硫酸氢钠测序（BGS）的5零件在选定的非小细胞肺癌细胞株的细胞和NHBECs这些基因区域。虽然大多数的56个CpG位点分析发现在A549 SPAG6甲基化（79%）是在nci-h1975（92%）细胞，只有少数的CpG位点的甲基化在NHBECs（4%，图2C）。SPAG6 CpG位点的甲基化在非小细胞肺癌和NHBECs之间的百分比差异有统计学意义（P0.0001）。l1td1甲基化CpG位点77%和24在A549和N

24、CI-H1975细胞株，分析93%然而，在NHBECs只有3%的CpG位点的甲基化对基因（图2F）。l1td1甲基化对非小细胞肺癌细胞株和NHBECs之间的差异有统计学意义（P0.0001。此外，我们决定在5乳腺癌l1td1 SPAG6和甲基化，2例结肠癌、卵巢癌2例，胰腺癌2以及2的头颈部癌细胞系。这些肿瘤细胞被认为是l1td1 SPAG6和甲基化和甲基化之间的71%的百分比（SK-OV3细胞）和98%（FaDu细胞）为SPAG6甲基化和之间的88%（BxPC-3细胞）和100%（FaDu细胞）为l1td1甲基化（附加文件1：表S4）。SPAG6和l1td1 NSCLC患者特异的甲基化是肿瘤

25、 我们还研究了由土、SPAG6 MS-HRM 146 I-III期非小细胞肺癌患者相应l1td1 NL样品的甲基化分析。在l1td1 SPAG6和甲基化土和NL样品之间的差异有统计学意义（P0.0001，分别）显示了基因的肿瘤特异性甲基化（图3a、b）。此外，ROC曲线分析结果发现，SPAG6甲基化以及l1td1甲基化能够区分屠的NSCLC患者（P0.0001，NL样品分别；图3a、b）。此外，每个病人的TN比值分别为l1td1 SPAG6和甲基化甲基化率在相应的NL样本 12 甲基化的原土/ %。考虑到T / N比1.5甲基化的患者，其中79%例SPAG6甲基化，81%例l1td1甲基化，分

26、别。此外，T / N比l1td1 SPAG6和甲基化进行甲基化结果与患者的临床病理特点。没有统计上显著的关联。 然而，我们观察到一个显著缩短OS患者鳞状细胞癌亚型和低SPAG6 mRNA的表达水平以及与腺癌亚型和低l1td1 mRNA表达水平的患者（附加文件3：图S2；HTTPS：/ / cancergenome。NIH。gov /）。在非小细胞肺癌患者SPAG6和l1td1 SNVs和缺失 如果调查除了甲基化等机制参与l1td1 SPAG6和转录调控，我们分析了SNVs中以及在LUAD和lusc SNP和aCGH数据集的非小细胞肺癌患者缺失的纯合子和杂合子。肺腺癌患者中只有3%有SPAG6

27、SNVs。虽然没有纯SPAG6缺失进行检测，其中22%例显示SPAG6的杂合性缺失（附加文件4：图S3）。肺鳞状细胞癌患者中只有2%被看到SPAG6 SNV。SPAG6缺失纯合子只有1%和杂合子SPAG6缺失检测中发现40%例患者。对SNV和删除类似的频率，发现l1td1（附加文件4：图S3）。SPAG6和非小细胞肺癌患者的l1td1蛋白表达的频繁流失 比较l1td1 SPAG6和甲基化在非小细胞肺癌患者的蛋白表达，采用免疫组化组织图和35的非小细胞肺癌患者亚组的NL样品。这些样品进行了分析和l1td1甲基MS-HRM SPAG6。SPAG6和l1td1蛋白表达在支气管和细支气管的NL sam

28、ples.l1td1蛋白表达的上皮细胞中也观察到肺泡上皮细胞检测。然而，没有或只有弱SPAG6染色检测60%在土样品的40%，分别为。此外，检测51%没有l1td1蛋白表达和弱染色在土族样本11%。中度或强染色的20%和17%分别涂标本。屠和NL样品代表染色是图4所示。当我们比较l1td1 SPAG6和甲基化与土样品蛋白的表达，观察蛋白表达下调SPAG6在SPAG6甲基化土样品77%个，下调l1td1蛋白表达在l1td1甲基化土样品的52%，分别为（图4c）。SPAG6和l1td1表达的生长、增殖的影响，存活率和集落形成能力的非小细胞肺癌细胞 调查潜在的肿瘤细胞生长抑制性能的l1td1，稳定转

29、染NCI-H1975细胞株与pcmv6-l1td1表达载体，用pcmv6输入矢量控制以及人工pCMV6-GFP载体。我们发现在肿瘤细胞的生长pcmv6-l1td1强相比减少pcmv6进入转染细胞（图5A）。在pcmv6-l1td1转染细胞的表达l1td1 RT-PCR（图5b）和ip-wb（图5c）。此外，我们分析了肿瘤细胞增殖，呈时间依赖性和观察到的降低的增殖率pcmv6-l1td1相比pcmv6进入和pCMV6-GFP转染细胞（图5F）。此外，我们发现了一个集落形成能力和肿瘤细胞活力pcmv6-l1td1转染细胞与对照组相比（图5D，E）。肿瘤细胞存活率之间的差异pcmv6-l1td1和p

30、cmv6转染细胞后48项有统计学意义（P = 0.0064）和72（P0.0001，但差异pcmv6-l1td1 pCMV6-GFP转染细胞并没有达到统计学意义。类似的在体外进行实验，但没有影响SPAG6。异位SPAG6表达对肿瘤细胞生长、增殖、存活率和集落形成能力看到（数据未显示）。l1td1减少体内肿瘤的生长 因为在体外实验表明肿瘤细胞生长的抑制性能l1td1，我们另外进行体内研究采用免疫缺陷小鼠。因此，pcmv6-l1td1和pcmv6进入转染细胞皮下注射到小鼠的腹侧核供应国集团。注射十天后，4/4只小鼠在两侧有可测量的病变。注射后第18天，两组间肿瘤体积差异有统计学意义（图6A）。注射

31、后第28天终止实验，切除肿瘤。肿瘤的解剖证实来自pcmv6-l1td1从pcmv6进入转染试验中发现肿瘤细胞的大小不同尺寸的测量（图6B），来自pcmv6-l1td1 NCI-H1975细胞株转染肿瘤l1td1表达RT-PCR（附加文件5：图S4）。讨论 在最近的一项研究中，我们对非小细胞肺癌患者进行了CpG岛甲基化的全基因组筛选，发现了400多个肿瘤特异甲基化基因。其中，SPAG6和l1td1，进行基因表达和甲基化特异的详细调查，潜在的肿瘤细胞生长抑制的性质在NSCLCs。到目前为止，关于这2个基因对肺癌发展的潜在影响的信息很少。SPAG6调节和某些类型的细胞增殖分化，属于“35,36 家庭

32、。正常的配子和滋养细胞表达，但在多种肿瘤中异常表达的 21 。它们的转录活性主要受表观修饰，包括甲基化和组蛋白乙酰化的调控（21, 37）。在生殖系CTAs以及在肿瘤组织中的作用却知之甚少，然而，由于生殖细胞和癌细胞有一定的特点，包括生化、侵袭和迁移，在不同类型的肿瘤的发展仅参与建议 37 。 l1td1参与人类胚胎干细胞的自我更新和多能性的调控。它在髓母细胞瘤细胞中高表达，与细胞存活率、化疗耐药和干细胞样性质有关（38）。 确定在多种恶性肿瘤l1td1 SPAG6和/或潜在的作用，我们分析了RNA-Seq数据集从TCGA数据库。而在所有类型的肿瘤和前列腺癌细胞的研究除了观察SPAG6 mRNA表达的肿瘤特异性下调，在NSCLCs发现的乳腺癌，下调l1td1 mRNA表达的结直肠癌和前列腺癌而不是在头部和颈部，肾和肝细胞癌。总的来说，这些数据表明，放松管制的表达SPAG6和l1td1不仅可以在非小细胞肺癌的发病机制中发挥作用，而且在其他实体肿瘤，这2个基因的表达与某些肿瘤类型之间