申报国家自然科学基金项目申请书样板.docx

1、申报国家自然科学基金项目申请书样板申报国家自然科学基金项目申请书样板各位申请人： 院科教部从我院申报国家自然科学基金项目中挑选了一份严格按照报告正文撰写提纲要求撰写，并在撰写的整体布局、写作方法上比较适宜的申请书作为样板申请书，提供给其他申请人在撰写申请书时参考。注：考虑到本项目也将申请国家自然科学基金，从技术保密方面考虑，涉及核心技术和关键问题之处将以“XXXXXXX”代替。报告正文（一）立项依据与研究内容1立项依据肝纤维化是严重威胁人类健康的重要疾病之一，迄今没有满意的治疗方法。目前国内外绝大多数学者认为，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活是肝纤维化的关键

2、，抑制HSC的激活对肝纤维化的防治有重要价值1。粉防己碱（tetrandrine，又名汉防己甲素）是中药粉防己（Stephania tetrandra S Moore）的主要有效生物碱成分，具有广泛的药理作用。抗肝纤维化是Tet的重要应用领域之一。我们研究室在过去的十几年中，对Tet抗肝纤维化作用及机制进行了系统研究，证实Tet是抗肝纤维化有效药物。然而，由于Tet的剂量安全范围较小，以往研究发现的抗肝纤维化有效剂量与中毒剂量比较接近，故成为限制其临床应用的重要因素。近年国内Tet抗肝纤维化研究也由此逐渐走向低谷。为减少毒副反应，拓展该药物的临床应用，我们近四年从降低Tet的单药剂量、联合用药

3、及改造药物毒性基团等方面进行实验性探索。新近，我们在国内外首次发现，低浓度Tet能上调转化生长因子（transforming growth factor factor ，TGF-）抑制性信号分子Smad 7表达，调控TGF-Smad信号通路，抑制体外培养静止期HSC活化，阻断TGF-1促静止期HSC活化效应，Tet还诱导活化HSC活化逆转。部分最新研究成果已经整理成文发表在本领域有一定影响力的SCI索引源期刊上，并被SCI收录(收录号 IDS Number: 963XN )2（相关文章参详见申请人简历及附件二、三）。这些全新研究成果进一步增强了我们开发这一传统中药的信心。TGF-1是目前认识的

4、最重要的促肝纤维化因子。抑制TGF-1对HSC的作用一直以来均是抗肝纤维化重要着眼点3。Smad 7是HSC TGF-信号通路的最主要负反馈调节信号分子，上调Smad 7是抑制TGF-对HSC不良生物效应的有措施之一4。在肝纤维化过程中，TGF-信号通路还与整合素信号通路存在密切联系。这表现在三个方面：XXXXXX。XXXXXX。XXXXXXXXX。综上所述，XXXXXXX，如能XXXXXX，可进一步实现XXXXX治疗。基于以上研究结果，我们研究室在国家自然科学基金资助下，过去三年中应用化学方法合成了RGD和M6P，并将RGD与M6P结合成一新型复合分子RGD-M6P，研究比较了它们对HSC靶

5、向性及在抑制其功能中的作用（项目名称：RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究，编号：30170412）。我们的研究发现，RGD和RGD-M6P均可抑制HSC活化。RGD在抑制TGF-激活同时，还可阻止HSC与ECM结合，阻断整合素信号转导。研究还发现，M6P能提高RGD作用于HSC的靶向性，增加其局部浓度，使RGD-M6P显示出较RGD更强的抑制作用14。我们首次证实，新型复合分子RGD-M6P用于抗肝纤维化治疗，无论在对HSC靶向的特异性，还是多位点联合作用方面，都优于单一的含RGD序列的肽段或M6P（参见基金结题摘要，相关文章参见申请人简历及附件四）。RGD-M6P新型复合分子

6、的研制成功及其对HSC靶向与抑制功能的发现，有助于我们去研究更多的HSC靶向选择性高、局部作用强、系统毒性小的新型药物和(或)制剂，从而提高药物的疗效、减轻毒性反应。结合我们对Tet药理作用的分子机制的研究结果，不难发现，XXXXXXXX。基于以上系列研究基础与设想，紧跟国内外在制剂学方面的进展，我们拟设计XXXXXXXXXXX。当前，受体调节药物靶向（receptor-mediated drug targeting）作为一种新型的给药系统受到人们的重视16。XXXXXXXXXXXXXXXXX。迄今为止，尚未见到XXXXXXXXXXX。结合国内外同行的研究报道与我们的研究基础，不难推断，XXX

7、XXXXXXXXXXXXXX。综上所述，我们拟在XXXXXXXXXX。本研究将为XXXXXXXX等提供理论与实践基础。XXXXXXXXXX可以设想，如能取得预期效果，经过良好设计的基础研究后，这一XXXXXX应用于临床的时间不会太久，前景广阔。参考文献1 Friedman SL. Mechanisms of disease: Mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2004;1(2):98-105.2 Chen YW, Li DG, Wu

8、JX, et al. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005;100(3):299-305.3 Breitkopf K, Haas S, Wiercinska E, et al. Anti-TGF-beta strategies for the treatment of chronic liver di

9、sease. Alcohol Clin Exp Res 2005;29(11 Suppl):121S-131S.4 Dooley S, Hamzavi J, Breitkopf K, et al. Smad7 prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in rats. Gastroenterology 2003;125(1):178-91.5 Ludbrook SB, Barry ST, Delves CJ, et al. The integrin alphavbeta3 is a receptor for

10、 the latency-associated peptides of transforming growth factors beta1 and beta3. Biochem J 2003;369(Pt 2):311-8.6 Annes JP, Chen Y, Munger JS, et al. Integrin alphaVbeta6-mediated activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-beta binding protein-1. J Cell Biol 2004;165(5):723-34.7 XXXXXXXXX

11、XXXXXXXX.2 项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题2.1研究内容：2.2.1XXXXX化学合成与鉴定，二硬脂酸磷酯酰胺XXXXXXXXXX 合成与鉴定。 2.2.2不同类型脂质体的制备、技术参数优化、物理性质鉴定和脂质体药物包封率、载药量、配体结合率鉴定与提高。2.2.3大鼠HSC分离培养，XXXXXXX 修饰脂质体与肝星状细胞体外结合活性研究。2.2.4XXXXX 修饰XXXXXXXXX 对肝星状细胞活化、增殖、XXXXXXX 信号通路影响。2.2.5XXXXXXXXX 的药代动力学特征、组织分布特征和XXXXXXX 研究。2.2.6 XXXXXXXX 对胆总管结扎和CCl

12、4大鼠肝纤维化防治作用。2.2研究目标：2.2.1研究构建XXXXXXXX，为抗肝纤维化药物新剂型开发提供新型靶向载体。2.2.2研究XXXXXX 对HSC生物活性影响及机制，为中西药结合肝纤维化双靶向、多靶点、协同治疗提供理论基础。2.2.3研究XXXXXXXX 体内HSC靶向性及防治实验性肝纤维化的有效性，为开发中药新剂型、提高药物在靶组织浓度、降低有效剂量、减轻副作用和提高疗效提供实践基础。2.3 拟解决的关键问题：2.3.1高药物包封率、高配体修饰率的稳定XXXXXXXX 制备。2.3.2放射性计数法测定XXXXXX 与HSC结合活性，有效抑制HSC活化的剂量、时间参数等。2.3.3X

13、XXXXX 体内HSC靶向性、抗肝纤维化效果比较与评价。3 拟采取的研究方案及可行性分析3.1 研究方案：第一部分XXXXX 及XXXXX 合成(1)XXXXXX 合成及鉴定采用我们研究室建立的方法，化学合成XXXXXX。应用XXXXXXXXXX。合成反应图示如下。高效液相（HPLC）、质谱等方法鉴定合成产物纯度及分子量。反应图（略）(2)XXXXXXXXXXX采用一步法合成。XXXXXXXXXXXX。合成反应图示如下。高效液相（HPLC）和质谱分析法进物产物纯化与鉴定。反应图（略）第二部分长循环脂质体制备、鉴定与技术条件优化 (1)脂质体制备采用经我们改良的逆相蒸发法制备。具体方法如下：XX

14、XXXXXXXX。(2)性质鉴定 XXXXXXXXXXXXXXXX。(3)均匀设计优化处方 根据实验结果及文献，确定影响包封率的主要因素。以包封率为评价指标，采用二项逐步回归计算回归方程，并进行方差分析，优化条件。第三部分 XXXXX修饰长循环脂质体与HSC体外结合活性采用两步胶原酶灌注和密度梯度离心法分离大鼠HSC，选择静止态和激活态的HSC，接种于6孔板上(细胞密度为5.0105/mL)。待贴壁后，1%胎牛血清DMEM培养过夜，细胞同步化。(1)配体结合的浓度-效应关系XXXXXXXXXXX。(2)配体结合的时间-效应关系 XXXXXXXXXXXX。(3)竞争抑制XXXXXXXXXX。(4

15、)细胞荧光定位、配体表面结合率与内吞率测定XXXXXXXXXX。(5)平衡解离常数(Kd )和细胞最大结合位点数(Bmax)XXXXXXXXXXX。第四部分 XXXXXXX对HSC生物学特性影响与机制采用酶法分离大鼠HSC。新鲜分离的HSC，体外培养48 h后，作为静止期HSC用于下游实验，或培养1 w后消化传代，继续培养24 h后，作为活化的HSC用于下游实验。(1) XXXXXXX对HSC活化状态影响XXXXXXXXX。(2)XXXXXX对TGF-1效应影响XXXXXXXXXXXX。(3)XXXXXXXX 大鼠HSC TGF-受体XXXXXXX 信号通路影响XXXXXXXXXXXXXX。第五部分 XXXXXXXXXXXX(1)XXXXXXXX 在肝纤维化大鼠体内的器官分布XXXXXXXXXX。(2) XXXXXXX 大鼠体内药代动力学采用XXXXXXXX。(3)XXXXXXX 在肝纤维化大鼠肝脏内分布采用XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX。第六部分 XXXXXXX防治大鼠肝纤维化(1)造模采用胆总管结扎和CCl4肝纤维化两种动物模型。(2)分组及处理XXXXXXXXXXXXXX。(3)治疗效果检测主要比较以下指标：XXXXXXXXXXXXXXX。3.2技术路线技术路线图（略）。3.3可行性分析3.3.1 立项依据有坚实