MS培养基及配制注意事项.docx

1、MS培养基及配制注意事项母液编种号类1大元 KNO3NH4NO3MgS047H201900165037017044022.38.66.20.831010101010、MS培养基母液的配制100100100100100100100100100100100100100100成分浓缩母液配制1升规定量倍数称取量体积培养基吸(mg)( ml)取量 定容 1900016500370017004400223062083252.52.53730278010025255000500105001010001010001000100101000100 素 KH2PO43微元 CaCl2 2H2OMnSO4 4H2

2、OZnSO47H2OH3BO3KINa2MoO47H2O0.250.0250.02537.327.82.00.50.10.5100CuSO4.5H2O4CoCL2.6H2O4铁 Na2-EDTA盐 FeSO4.4H2O5有机甘氨酸盐酸吡哆醇盐酸硫铵素烟酸6 肌酸注意： 1大量元素按照使用时高 10倍的数值称取，分别将各种化合物称 量后，除 CaCl22H20 单独配制外，其余化合物混合在 500ml 烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻 璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存， 贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名， CaCl2 2H20

3、配制同上置于另一小口瓶中。 2微量元素母液的配制按要求浓缩 100 倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（ FeS04 7H20 和 Na2-EDTA.2H20）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在 1000ml 容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。3铁盐配制将 FeS04 7H20 和 Na2-EDTA.2H20 分别溶于 450ml 蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液 混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。4有机物母液配制，按母液要求浓缩 50 倍，除蔗糖按 3%单独临时称量 外，其余分别称量后，溶解，定容

4、在 500ml 容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴 上标签。5 .母液最好在24C的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过 长,无机盐母液最好在一个月内用完,如发现有霉菌和沉淀产生,就不能再使 用。1制备母液和营养培养基时,所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求, 化学药品必须是高纯度的（分析纯）。2称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。生长调节剂母液配制： 为了操作方便,节约时间,生长调节剂也可如同配制母液一样,先配成原液,这样配制培养基时只要稍加计算,按需要量取即可。不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA）,吲哚乙酸（lAA）,赤霉素（GA3）, 2

5、, 4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加 水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量 1mol/L 的盐酸中,叶酸需用少量稀氨水溶解。称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母 液每毫升则含有生长调节物质 0.5mg,配制后一般要求在低温（04C ）保存, 配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为 0.5mg时，则取 1ml 母液即可。二、培养基配制和灭菌养培养基配制程序（一）.母液吸取量的计算配制培养基的升数公式1母液吸取量二母液体积（CQ X母液浓缩倍数培养基要求的含量各种生长调节剂）公式

6、2：母液吸取量 =母液每CC的含量二）各种母液按顺序编号排列A.大量元素；B.CaCl2.2H20； C微量元素；D.铁盐；E有机物；F.生长素萘乙酸（NAA）:配制0.5mg/ml的NAA称取50mg, NAA用少量95%酒精溶解后加蒸馏水定容至 1000ml； G.细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT称50mgKT用少量 1N HCL溶解后，加蒸馏水定容至100ml。（三）配制培养基（ 1000ml）1.琼脂:称取57g琼脂，加入300ml蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止.2.蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取 30g白糖，溶于溶有琼脂的300ml 蒸馏水中。3.各种母液的

7、吸取（培养基 1L）（1）用50ml量筒量取大量兀素母液（A）和CaCl2 2H20 母液（B）各 100ml（2）分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C）,铁盐（D）母液各10ml3）用 10ml 移液管或吸管吸取有机物（ H） 10ml 4）移取激素将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至 80 C左右，用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH 般要求5.86.0,过酸过碱则用 INNaoH 禾 n 1N HCL调整。2.分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基， 1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中，每个三角瓶约 30ml 左右（一般占试管、三角瓶容量 1/41

8、/3 左右）注：培养基勿碰瓶壁。3.包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行灭 菌。用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。三、高压蒸汽灭菌锅的使用方法具体操作步骤：1.高压锅放水至平把架；2.把包扎好的培养基装入高压锅 ;3.盖上热压锅盖 ,上紧螺帽 （注意对角拧紧螺帽 ）关上气阀和安全阀 .4.然后接通电源 .5.压力计升至0.05MPa时，打开放气阀，排除冷空气（此步很重要）。6.排除冷空气后 ,关闭放气阀，待压力升到 0.11MPa 位置时，开始计算灭菌 时间，具体方法：当压力锅指针升至 0.12MPa

9、 时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa时接通电源，不断重复此操作过程，维持 20分钟。7.灭菌时间达到 20分钟后，除去电源，打开放气阀 （注意要逐渐放气 ）待高 压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖 （注意对角扭松螺帽 ）稍待冷后再把 培养基取出。8.经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检 查培养基有无微生物污染，可将培养基置于 25C下保存4天，如果培养基需要 贮存较长时间，可在4C低温下保存。灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论 哪种型号，操作的步骤都很相近。进水T放进培养基7盖紧锅盖T关上放汽阀T检查安全阀7接上加热源T待

10、压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀 70.11MPa（12TC）下灭菌2025 分钟，保持稳定压力 7除热源 7逐渐打开放气阀 7锅内空气排除完后 7开放锅盖 7稍冷后取出培养基。四、无菌操作技术一）植物材料表面 消毒剂灭菌从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。 1.接种步骤：第一步：清理材料 77流水冲洗 77加入吐温（或洗衣粉）清洗自来水冲洗第二步：第三步：对材料的表面浸润灭菌： 70%酒精浸 10-30 秒77无菌水灭菌剂处

11、理 77 041%升汞5-8 min （或其他灭菌剂）注意事项：.灭菌剂一般要临时配制，现配现用升汞可以短期储存2 对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3 - 4次，升汞一般5 - 8次,每次不少于3 min3灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底.4灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。5.灭菌液要充分浸没材料2.无菌操作可按以下步骤进行：（1）在接种 3 天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前 3 小时打开其内紫外线 灯进行杀菌；（2）在接种前 20 分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等； （ 4）上工作台后，用

12、酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；（ 5）用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火 尖端处，对培养皿要过火烤干；（ 6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。（如1-2叶片切成0.5cm的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含 片叶原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌 30 分钟，若连续接种，每 5 天要大强度灭菌一次。常用植物激素类别素a萘乙酸吲哚 3乙酸吲哚 3丁酸裂N-异戊烯氨基嘌呤玉米

13、素）素赤霉素 GA3346.4 能溶于乙醇不耐热不能高压灭菌在愈伤组织和悬浮培养物的启动和 保持生长时才需要有时小植株再生时也需要 ZT219.26-糠基氨基嘌呤 KT215.26-苄基氨基嘌呤 NAAIAAIBABA186.2175.2203.2225.20.001- 10mg/L0.001- 10mg/L0.001- 10mg/L分裂素通常能溶于稀NaOH含水乙醇或稀盐酸玉米素不耐热，不能高压灭 菌。名称2，4二氯苯氧乙酸缩写词2，4D 分子量221.0 使用浓度范围0.001 - 10mg/L母液配制生长素通常用 NaOH溶液滴至溶解成溶液。能溶于乙醇说明 IAA 易被植物细胞所氧化。故

14、培养基中很少单独使用。四、常用药品的配置方法1.1mol/L HCl的配制：根据盐酸的密度37%盐酸溶液的密度为1.19克/毫升，假设要配制1000ml1mol/LHCI,则需要盐酸的物质的量为1mol，所以需要量取 37%的盐酸为 1*36.5/37%/1.19=82ml2.1mol/L的NaOH的配制：称40gNaOH然后融于1000ml的蒸馏水中。 定容到 100ml)3.95%的酒精配制成75%的酒精：用量筒量取750ml的95%酉精加入200ml 的蒸馏水即可得到 75%的酒精。如果用无水酒精配制 75%的酒精，则量取 750ml 的无水酒精，再加水250ml。4.0.1%的升汞配制：先称取 1 克升汞粉末，然后用蒸馏水溶解最后定容到1000ml。5.1mg/ml的2.4-D的配制：称取0.1g2.4-D,用少量1mol/LnaOH或酒精助溶，然后定容到 100ml。6.1mg/ml的6-BA的配制：称取 0.1g6-BA 用少量1mol/L HCI或 1mol/LNaOH助溶，然后定容到100ml。7.0.5mg/ml的NAA的配制：称取0.05gNAA用少量95%酒精助溶，然后定 容到 100ml。