附红细胞体感染小鼠的血液学指标检测及药物治疗效果的观察.docx

1、附红细胞体感染小鼠的血液学指标检测及药物治疗效果的观察附红细胞体感染小鼠的血液学指标检测及药物治疗效果的观察摘要 目的：检测附红细胞体感染小鼠后的血液学指标变化拟对附红细胞体的发病机理进行探讨。对附红细胞体感染小鼠进行药物治疗效果观察，以便为临床合理用药奠定科学基础。实验方法：1. 附红细胞体感染小鼠的血液学指标检测：用了光学显微镜镜检、透射电镜观察以及PCR检测方法检测附红细胞体。将感染附红细胞体的患者进行附红细胞体的分离纯化并作为感染源注射SPF级昆明小鼠，感染后通过血液压滴片镜检，PCR检测及透射电镜检测鉴定模型建立成功，检测红细胞膜ATP酶活性、血液常规指标、红细胞SOD酶活性、红细胞

2、免疫功能、一氧化氮含量。2附红细胞体感染小鼠的药物疗效观察：随机将48只感染附红细胞体的小鼠分成4组，每组12只。第一组为感染组，第二组为感染后不治疗组称为阳性对照组。第三组为青蒿琥酯治疗组，剂量为60mg/kg，第四组为丁胺卡那霉素联合青蒿琥酯治疗组，丁胺卡那霉素的剂量为400mg/kg，青蒿琥酯的剂量为60mg/kg，连续治疗7天。再取12只正常小鼠为阴性对照。每天从感染的小鼠各采血制成鲜血压滴标本，油镜镜检。观察其感染率，测定血液常规指标，在治疗7天后，对血样进行PCR检测。 结果：鲜血滴片镜检和瑞氏-姬姆萨染色涂片均能清晰地观察到附红细胞体的形态结构，通过透射电镜可以观察到附红细胞体的

3、超微结构，发现附红细胞体附着于红细胞表面。根据已有的猪附红细胞体特异性片段设计引物，成功地扩增得到801bp 的PCR产物。附红细胞体感染组小鼠的红细胞数量显著低于正常组小鼠的红细胞数量（P0.01），附红细胞体感染组小鼠的血红蛋白含量、RBC-C3b花环率、红细胞的ATP酶含量显著低于正常组小鼠的血红蛋白含量、RBC-C3b花环率、红细胞的ATP酶含量（P0.05）附红细胞体感染组小鼠的嗜中性粒细胞数略低于正常组小鼠的嗜中性粒细胞数（P0.05）附红细胞体感染组小鼠的白细胞总数、淋巴细胞数、NO含量略高于正常组小鼠的白细胞总数、淋巴细胞数、NO含量（P0.05），附红细胞体感染组小鼠的RBC

4、-IC花环率高于正常组小鼠的RBC-IC花环率（P0.05）。 各组的感染情况见图1和表2，经过青蒿琥酯联合丁胺卡那霉素治疗，附红细胞体感染率逐渐降低，到给药结束，红细胞已恢复正常，并且在给药后第5天，感染率降为0%，单用青蒿琥酯治疗到给要结束红细胞基本恢复正常。阳性对照组在未经治疗后的第7天附红细胞体的感染率为21.08%，与青蒿琥酯联合丁胺卡那霉素组、青蒿琥酯治疗组相比有显著性差异（P0.05）。经过药物治疗后，青蒿联合丁胺卡那霉素组和青蒿琥酯组的红细胞数明显增加（P0.01）、血红蛋白含量明显增加（P0.05）。各组小白鼠血液样本经PCR检测，感染组和阳性对照组出现特异性片断，青蒿琥酯组

5、和青蒿联合丁卡组未扩增出特异性片断。结论：1采用鲜血滴片镜检，瑞氏-姬姆萨染色镜检，透射电镜镜检的方法均可作为检测附红细胞体的手段。但是光学显微镜镜检存在一定的不足和缺陷，本文采用了PCR检测和透射电镜检测方法可以特异性检测出附红细胞体。临床应用中，可将光学显微镜检和分子检测、透射电镜检测方法相结合，取长补短，作为附红细胞体病的检测方法。2附红细胞体可以感染SPF昆明小鼠。采用6周龄昆明小鼠作为实验动物，以纯化的人附红细胞体作为感染源攻毒，可以使SPF昆明小鼠感染人附红细胞体，成功地建立了感染模型。3本实验在所建立的SPF小鼠感染模型的基础上，研究了附红细胞体感染所引起小鼠血液学指标的变化，附

6、红细胞体感染组小鼠与正常组小鼠相比：红细胞数量明显减少，血红蛋白含量明显下降、红细胞压积略有下降、嗜中性粒细胞数减少、白细胞总数和淋巴细胞数略有增加，RBC-C3b花环率、红细胞的ATP酶含量、SOD酶活性明显降低， NO含量、RBC-IC花环率明显增加。因此附红细胞体感染造成红细胞膜结构发生变形，使红细胞易于溶解和破裂，造成血液中生理生化指标发生改变，红细胞内外阳离子平衡失调、造成红细胞免疫功能低下。4青蒿琥酯联合丁胺卡那霉素治疗比单用青蒿琥酯治疗效果好，能迅速清除体内附红细胞体，使红细胞的功能和数量迅速恢复正常，使得机体彻底康复。1引言 附红细胞体病是附红细胞体寄生于猪、牛、羊等动物红细胞

7、或血浆中引起的一种传染病，主要以发热、贫血、黄疸为主要临床症状。随着畜牧养殖业的不断发展，本病也有不断蔓延的趋势，全国大多数地区基本都有本病发生，给我国畜牧养殖业造成严重的经济损失，成为危害当前畜牧养殖业的主要疾病之一。 附红细胞体在全球发现的历史较早。1928年，Schillig和Dingen等几乎同时在啮齿类动物中查到类球状血虫体（E.coccoides）2；1932年Doyle3在印度首次报道了“猪的一种立克次氏体病或类微粒孢子虫病”；而后在1934年由Neitz等4在绵羊红细胞上或在其周围发现有多形态的微生物寄生，将其命名为绵羊附红细胞体(E.ouis)；Adler等5在牛体中也发现形

8、态与类球状血虫体相似的微生物；而Kinsely等6则揭示了猪的类边虫科病原体引起的疾病；1950年Splitter等7证实了Kinsely 等发现的类球状血虫体是引起猪黄疸贫血病(Ictero-anaemia)和类边虫病(Anaplasmosis-like disease)的真正病因，并将此病原命名为猪附红细胞体( E.suis )。1986年，Puntaric等8正式描述了人的附红细胞体病。我国是附红细胞体病感染最为严重的国家之一，但是对于此病的研究较晚。1981年晋希民9最先报道了兔附红细胞体病；随后1982年许耀成等10首次在江苏南部查到猪附红细胞体（E.suis）；1990年全炳昭首次

9、报道了犬的附红细胞体病；1991年华修国11，12在上海发现犬的附红细胞体病和仔猪附红细胞体病，随后相继有许多报道在畜禽中发现存在附红细胞体病。1991年内蒙自治区邰秀珍等13在国内首次报告人的附红体病病例；1992年，冯立明、裴标等又先后报道了人附红细胞体病14；1993年，我国在卫生部的关注下，组成了附红细胞体病调查组，由尚德秋等人对此病进行了系列的流行病学研究，并证实了附红细胞体病在人群中的感染情况。 目前我国是附红细胞体病流行最为严重的国家之一, 该病已经对人类生命安全构成威胁,但是该病并没有引起人们的高度重视，因此我们应对该病提高警惕。2. 病原学2.1 附红细胞体形态学 由于附红细

10、胞体的宿主种类繁多，宿主的发病阶段也不尽相同，这些因素造成所观察到的附红细胞体的形态结构有所差异，表现出多样性。1985年Zachary等15和1992年Liebich等16分别报道，在电镜下可见猪附红细胞体主要有三种形态，即球形的未成熟的附红细胞小体和盘形的幼年附红细胞体以及环形的成熟的附红细胞体。也就是代表了猪附红细胞体发展的三个不同发展阶段。光镜下的附红细胞体呈环形、小球状、卵圆形或杆状等多种形态，有折光性，大小从0.32.6 um不等。附红细胞体无细胞壁，仅有单层界膜，无明显的细胞膜和细胞器，整个结构呈单层膜包被的圆盘状。它们单独或成链状附着在红细胞表面，或围绕在整个红细胞上，在血浆中

11、也可见到自由游动的附红细胞体。附着于红细胞表面的附红细胞体则较难看出其运动性，而游离于血浆中的附红细胞体可见做摇摆、扭转、翻滚等运动17。据报道猪附红细胞体外有一层膜包被，在包浆膜下有直径10nm的微管，有核糖体颗粒，无明显的细胞及核的结构。这些生物体黏附于红细胞的表面的浅凹窝和深沟内，而不是穿入红细胞的内部，由一个1525 nm的清晰区域将其与红细胞分隔开。这些生物体表面有纤丝，这些纤丝穿过清晰区域扒嵌在宿主红细胞上，该结构可进一步解释红细胞因纤丝扒嵌其表面引起红细胞膜产生凹陷、变形，导致红细胞结构和功能改变，乃至破碎溶血的原因18，19。2.2 生物学特性 附红细胞体在动物机体内存在方式有

12、两种，一是游离于血浆中，另一种是附着于红细胞表面。关于附红细胞体的运动性，多数学者认为游离于血浆中的附红细胞体能自主地作上升、下降、前后翻滚、扭转等不规则运动，其中单个大型附红细胞体活动弱于小型附红细胞体，而聚集成团状者活动力减弱或无活动力。 关于附红细胞体的染色特性，认为苯服色素易于着染，革兰氏染色为阴性，姬姆萨氏染色呈紫红色，瑞氏染色呈淡兰色20。而在吖啶橙染色则呈现出两种不同的荧光，一种为较大的呈现桔红色荧光的附红细胞体，提示有RNA的存在，另一种为较小的呈现淡绿色荧光的附红细胞体，提示有一定数量的DNA存在。因此，推测附红细胞体的遗传物质可能包括分别为DNA和RNA的两种类型。 附红细

13、胞体不受红细胞溶解的影响，对干燥、热和化学药品敏感，对低温的抵抗力较强。一般常用消毒药均能杀死病原，如在5gL-1石炭酸中373 h就可以被杀死，在含氯消毒剂中作用1 min即全部灭活。在含碘消毒剂中，附红细胞体很快停止运动并失去活性，用无菌PBS洗涤后，也不能恢复其活动力，更无感染力21。 附红细胞体对温度较敏感。在75-100水浴中作用30s-1 min，附红细胞体即失去活性，停止运动。在0-4冰箱中，附红细胞体可存活60d，并保持其感染能力，达到90d时，仍有近30%左右的附红细胞体具有活动力22。附红细胞体对干燥也很敏感。将附红细胞体悬液滴于玻片上，置室温使其自然干燥，在1 min内，

14、将涂片上附红细胞体复溶后，一部分附红细胞体仍有活动力，但很弱。2 min后，片子上的附红细胞体全部停止活动23。2.3 分类和分子病原学 目前，关于附红细胞体的分类问题，国内外尚有争议，世界范围内对附红细胞体的归属尚不统一。有学者认为附红细胞体应归属于立克次氏体，也有学者认为应归属于原虫，还有学者认为应归属于霉形体目24，25，26。国际上广泛采用伯杰氏细菌鉴定手册统一分类，将附红细胞体列为立克次氏体目(Rickettsiales)、无浆体科(Anaplas-mataceae)、附红细胞体属(Eperythrozoon)。但是近年来有分子生物学的证据对病原的基因序列(16SrRNA)分析结果表

15、明，有些附红细胞体如寄生于鼠类的球状附红细胞体(E.coccoides)、寄生于羊(绵羊和山羊)体内的羊附红细胞体(E. ovis)、寄生于猪体内的猪附红细胞体(E. suis)和小球附红细胞体(E. parvum )及寄生于牛体内的温氏附红细胞体(E.wenyonii)的16S rRNA 序列更接近于支原体属(Mycoplasma)生物的16SrRNA 序列，因而提议应该将巴通体属及附红细胞体属的生物都统一归类为柔膜体纲支原体属。但ilenberg等认为将这2个属的所有种都归类为支原体属的证据并不很充分。因为并不是所有的巴通体属和附红细胞体属的生物的16SrRNA基因序列与支原体属都有高的同

16、源性。因此，附红细胞体的分类及各种属附红细胞体的致病性尚有待于进一步深入研究。 附红细胞体病的分子病原学研究尚不够深入。迄今为止，对附红细胞体基因组知道的很少。已在Genebank上登录了10个包括猪的、狗的、猫的、羊的、牛的等种属的16S rRNA序列，和11个开放阅读框的基因序列，尚没有已知功能基因的报道。Messick等27用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和限制性酶切片段测定了猪附红细胞体的基因组，是环形的DNA，全长约为730-770 kb，通过Southern杂交表明，16S rRNA基因座落在120 kb MLu，128 kbNru，25 kb Sac和217 kb Sal片段上。Me

17、ssick等28构建了Mycoplasma haemofelis 的物理图谱，证实Mycoplasma haemofelis 基因组大小为1.2 mb，并完成了其中280 kb的序列测定。其中18.6%的基因序列与猪附红细胞体基因序列同源性较高，74%与猪附红细胞体不匹配。除了16S rRNA基因序列外，Hoelzle等29克隆了猪附红细胞体1.8 kb的片段，用软件分析后发现该片段有11个假定的CDS(编码蛋白的核酸序列范围)，并且根据CDS推断的氨基酸序列不能与蛋白质数据库中已知的蛋白质相匹配。但是这些CDS的作用未被进一步阐明。由此可见，要阐明附红细胞体跨种间感染与传播机制，在附红细胞体

18、分子病原学研究方面尚存诸多空白急待填补，加上附红细胞体体外培养方法还未成熟，尚待进一步完善，不容易稳定地获得高纯度的核酸，无法在分子水平上比较不同种属宿主来源附红细胞体的结构和功能，制约了附红细胞体跨种间感染与传播的分子变异机制的研究。2.4 生活史 附红细胞体的生活史至今尚不十分清楚，国内外学者根据附红细胞体发生的季节，认为吸血节肢动物是该病原的主要传播媒介，也有实验表明附红细胞体在血液中主要利用葡萄糖得以生存。一条茂和邰秀珍报道30，31认为骨髓是绵羊和人的附红细胞体的主要增殖部位。吉增福32在绵羊血液中观察到双卵圆形体，认为附红细胞体是在红细胞上是以二等分裂或出芽方式进行增殖的。3 流行

19、病学3.1 流行近况 附红细胞体是人畜共患传染病，可感染附红细胞体的动物有啮齿动物（包括鼠、兔）、草食动物(包括牛、绵羊、山羊、马、驴、骡、骆驼、牦牛)、肉食动物(包括犬、猫、银狐、貂)、野生动物（包括南美洲驼羊、北极驯鹿）及杂食动物猪。猪感染附红细胞体后发病最为严重，可造成巨大的经济损失。猪附红细胞体的感染率可高达90%以上，致死率在70%90%39。1991年邰秀珍等报告了我国首例人体附红细胞体病病例,后陆续有病人报道。到目前为止,北京、江苏、内蒙古、广东、云南、河北、安徽、山东、辽宁、上海等地的20余例临床病例报告中,近5年报道的占总病例数58.33% ,呈逐年增加趋势。近年大量流行病学

20、调查表明,本病在我国并非罕见,但发现病例不多,其主要原因是过去临床医生对本病认识不足,在临床表现上与感冒、疟疾、贫血等疾病易相混淆,医疗单位又缺乏特异的实验诊断手段,致使病例不易被发现。人群感染率调查均采用直接镜检法查找病原,从全国各地调查情况看,其感染率在3.27% 93.53%。综合全国15个省、市、自治区32个地区12969人调查，人群平均感染率为43.89%。而个别地区如河北灵长县人群附红体的感染率却为0，一些献血员的感染率甚至高达80%34。感染率虽高，发病者较少 33 。 3.2 感染特征 附红细胞体有其特异的宿主，不同动物的附红细胞体有不同的命名。寄生于牛的温氏附红细胞体不能感染

21、山羊、鹿和去脾绵羊；感染美洲驼的附红细胞体不能感染猪、绵羊和猫。但同时附红细胞体也存在一定的跨种间感染与传播。绵羊附红细胞体既可感染绵羊，也可感染山羊；有人用病猪内脏悬液接种小鼠，再取小鼠病料接种家兔使其感染获得成功35；用病牛血清也可使近交系BALB/C小鼠感染附红细胞体35；马增军等36进行人工感染试验时发现猪附红细胞体可使绵羊感染发病。由此可见，附红细胞体既有相对宿主特异性，又能跨种间感染与传播。 人附红细胞体的感染与人从事的职业和季节是有密切关系，而与性别，年龄无关。农民，兽医和住在乡镇的人容易感染附红细胞体，这可能与这些人有意或无意于动物相接处有关。近年来对城市人口进行的流行病学调查

22、显示城市白领附红细胞体的感染率较高，有报道显示上海近千例“白领”的体检报告显示，其中三成人感染了附红细胞体37，这可能跟他们的生活习惯有关，常吃快餐，饮食无规律，家中饲养宠物。有报道认为年龄小，高龄，免疫功能低下附红细胞体的感染率要比健康人高38。因此，尚德秋等人的推论认为附红细胞体的感染与机体的免疫力是有关系的。3.3 传播途径3.3.1 接触动物传播 关于附红细胞体传播途径，研究得也还不够透彻。国内外趋向于认为吸血昆虫可能起传播作用。也有人认为，通过接触、体液、垂直传播及食用动物性食品等途径均可感染此病，但未见经呼吸道和消化道传播此病的报道。通常附红细胞体病的传播方式主要有3种: 经吸血昆

23、虫和节肢动物传播，在夏秋或雨水较多的季节，吸血昆虫的活动、繁殖为该病的传播起到了关键媒介作用，常见的吸血昆虫和节肢动物有猪虱、蚊虫、鳌蝇、蠓、蜱等。但到目前吸血昆虫和节肢动物传播机制尚属未知。垂直传播，是目前最受重视的传播方式，新生仔猪经垂直感染而患此病。血源性传播，动物之间可通过摄食 血液、含血的食物、舔断尾的伤口、咬尾或喝被血污染的尿、交配等相互传播。人为因素也可能造成该病的传播，如使用被污染的注射器。接触性传播也就是人与动物或动物之间的相互传播。1986年Puntaric等40报道的一例人因与家畜接触发生感染，而1989年Mason等人41用E. ovis实验感染山羊，感染后与健康山羊，

24、绵羊接触，18个月后都没有发生感染。所以接触性传播是否成立，是否传播具有方向性，对象性或特异性等都有进一步的研究。3.3.5 其它传播途径古巴、法国、德国、尼日利亚等国的调查都认为进口肉畜、种畜是本病最重要的传播因素。4250天的婴儿血中检出附红细胞体，尚属首例。母亲呈隐性感染，婴儿急速发病，这可能与婴儿吃奶时发生交叉感染有关。434. 致病性 由于附红细胞体体外培养比较困难，并且其生活史方面了解的也较少，因此目前关于附红细胞体病的致病机理了解得不是很清楚。一般认为，感染附红细胞体以后，其机体免疫功能下降，导致继发感染增加，有时不一定表现出临床症状，在机体抵抗力下降或处于应激时附红细胞体感染率

25、上升，感染的红细胞比例达到一定程度时才会引起发病44。 附红细胞体促使红细胞在体内清除过程加快，红细胞提前大量衰亡。附红细胞体寄生在红细胞膜表面，其分泌的唾液酸酶及蛋白酶对所黏附的红细胞必然造成损伤。附红细胞体寄生改变了红细胞膜的通透性，导致红细胞膜凹陷和空洞，易溶解和破裂，使红细胞数减少，血红蛋白降低，导致机体出现贫血、黄疽、酸碱失衡等，而被感染红细胞的携氧能力降低，则可导致贫血和呼吸困难。被损伤的红细胞易被吞噬细胞所吞噬，而且在通过脾脏时很容易被识别和清除，这是与红细胞感染有关的寄生虫造成贫血的一个主要原因之一。 另外，在正常情况下，红细胞膜极柔软，十分容易变形，附红细胞体感染改变了红细胞

26、的表面结构，致使其变形，经过脾脏时会被清除，因而引起一种经凝集素和溶血素介导的或与之有关的自身免疫溶血性贫血。随着感染强度的增加，反映红细胞变形性的红细胞刚性指数(RI)和变形指数(TK)增高，红细胞的硬度增大，变形性降低，一方面影响了血液在小血管和微血管内的流动性，使组织和器官的血液灌注减少，并影响了组织和器官之间的气体交换，从而引起缺氧、酸中毒及组织坏死等一系列病理变化。Smith等45报道，由于病原体的大量的繁殖和新陈代谢，机体的糖代谢大量增加，出现低血糖。隐性感染的动物的血糖浓度可比正常动物的下降25%左右，急性感染则严重更多。患病动物往往由于血液中乳酸和丙酮酸含量上升而导致酸中毒，被

27、感染的红细胞携带氧气的能力降低，影响肺脏的气体交换，常导致机体的呼吸困难。同时附红细胞体吸附于红细胞以后，红细胞膜的通透性和膜的脆性增加，红细胞容易溶解和破裂，使得红细胞膜表面的隐蔽的自身抗原暴露后刺激机体产生M型冷凝素自身IgM抗体46，47，导致II型过敏反应，进一步引起红细胞的免疫性溶解。使红细胞数减少，血红蛋白降低，导致机体出现广泛的溶血性贫血。同时大量吸附有附红细胞体的红细胞被机体的脾脏和全身的单核巨噬细胞所吞噬，同时也加剧了溶血性贫血的发生和黄疽及血红蛋白尿的形成。有学者认为红细胞形状的这些变化会影响其流动性和对渗透压的抵抗力48。猪附红细胞体的潜在感染对凝血没有影响。 附红细胞体

28、抑制红细胞产生。邰秀珍等认为骨髓是绵羊和人的附红细胞体的主要增殖部位。Pospischil等49报道附红细胞体在不同生长阶段形态大小变化很大，于骨髓中大量增生后释放到血液中。附红细胞体寄生在骨髓组织内，必然影响骨髓的正常造血功能。虽然目前还不清楚附红细胞体在骨髓组织内大量寄生的原因，但多数学者认为与附红细胞体对红细胞前体(网织红细胞)有特殊的亲和力有关。5.诊断5.1.1 鲜血压滴观察法 静脉采血，取一滴血均匀涂布于载玻片上，加等量生理盐水稀释后轻轻盖上盖玻片，在400倍显微镜下观察，可见到红细胞表面附着有附红细胞体，感染严重的红细胞失去球形立体形态，如布满突起的蓖麻球或呈现菠萝状，边缘不整而

29、呈轮状、星芒状、不规则多边形等。有的游离在血浆中呈不断变化的星状闪光小体，在血浆中不断地摆动、翻滚，加入0.1%碘溶液或0.05g/L的四环素溶液则停止活动，吸附在红细胞表面的附红细胞体也脱落下来50。5.1.2 血涂片染色镜检法用载玻片制成薄而均匀的涂片，使红细胞各个分离排列，用姬姆萨染色液染色，见红细胞上的附红细胞体呈蓝紫色，有折光性，外周有白环，当调动微调时，折光性较强，附红细胞体中央发亮，大小不等，直径在0.3-0.8m，附着在每个红细胞表面的附红细胞体数为5-10个，多者达15个以上51，52，53。5.1.3 扫描电镜观察法 主要用于研究附红细胞体的形态、结构及其与红细胞的关系。扫

30、描电镜可见附红细胞体大小不一，大多为球型小体，偶见杆状，均寄生在红细胞表面，可单个、多个呈小团状附着其表面。附红细胞体寄生在红细胞膜上可使附着的局部呈凹陷状态，个别可见膜表面形成洞。附红细胞体是个无核、无细胞器的原生体，只有单层膜包裹，其中可见电子密度大的颗粒状物，无规则分布在胞浆内54，55。5.1.4 透射电镜观察法 在透射电镜下，附红细胞体为大小不等的以球形小体为主的多形性小体，在大型附红细胞体上可观察到细长的纤毛，也可观察到其膜有突起。5.2 免疫血清学诊断 免疫学诊断是诊断该病的重要方法之一。目前，国内外在附红细胞体的血清学诊断方面已取得一定进展，包括补体结合试验(CFT)、间接血凝

31、试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光抗体实验等。方法虽多，但用不同方法检查得到的结果往往差异很大。这些方法可以用于附红细胞体病的诊断以及流行病学调查及监测。5.2.1 补体结合实验 A.Splitter于1958年首先将补体结合实验用于诊断猪附红细胞体病，对于急性病型的诊断效果好。在病猪急性期采血，一般在体温升高到40.5-41.5 1-3 d后，患畜血清即呈阳性反应，一周后逐渐转为阴性。慢性感染和隐性感染猪则不易查出阳性反应。5.2.2 酶联免疫吸附实验 A.Frank等1992年56对用ELISA与间接凝集试验(IHA)两种方法检测猪的附红细胞体的结果进行了比较分析，发现其

32、两者间差异极其显著，ELISA比IHA更为敏感。孟日增57建立了猪附红细胞PPA-ELISA诊断方法，结果显示，用抗原难以有效检测到自然感染猪血清中的特异性抗体，但用阳性血清可有效检测到猪附红细胞体，阳性检出率约100%。5.2.3间接血凝抑制实验 Smith 1975年58使用该方法用于感染动物的多个发展阶段检查，比补体结合实验敏感性高，能检测出补体结合反应转阴后的耐过猪。当间接血凝试验滴度超过或达到1: 40，则可以判断为阳性。5.2.4 荧光抗体实验 IFA最早用荧光抗体实验来诊断牛附红细胞体，结果显示抗体在感染后第4d出现，抗体水平随感染率而上升，到感染后28d可达高峰。5.3 分子生物学诊断5.3.1 PCR检测 Messick59首次用针对猪附红细胞体 16S rRNA基因