羊骨胶原蛋白酶解产物对去卵巢青春期大鼠垂体激素释放的影响.docx

1、羊骨胶原蛋白酶解产物对去卵巢青春期大鼠垂体激素释放的影响第三章 羊骨胶原肽和类固醇激素对去卵巢青春期大鼠垂体激素释放的影响摘 要【目的】本研究旨在研究羊骨酶解物（羊骨胶原肽）对去卵巢青春期大鼠类固醇诱导的催乳素和促黄体生成素分泌浪潮的调节作用。【方法】以6周龄阴道未开口的青春期雌性SD大鼠为实验动物，实施双侧卵巢摘除手术，术后康复1周（第一组,Grp1）或3周（第三组,Grp3）后，进行类固醇替代注射处理（E+P）,第二组(Grp2)和第四组（Grp4）大鼠在康复1周或3周后类固醇替代的同时以灌胃的方式给予羊骨酶解物（E+P+ S），第五组大鼠（Grp5）卵巢切除之日便开始灌胃给予羊骨酶解物，

2、在术后康复3周后进行类固醇替代处理。类固醇替代方法为实验第一天皮下注射17-雌二醇（50g/kg，sc），第三天注射孕酮 (2.5 mg/kg, sc)。羊骨酶解物的灌胃剂量为1000mg/kgd。所有大鼠均在E+P处理组雌二醇注射后即服用羊骨酶解物后的第1、8、12、16、20、28、36天采集血样，血样通过在类固醇替代即实验第二天手术植入的颈导管采集。通过放射免疫技术测定血样中的促黄体素和催乳素浓度。【结果】试验结果表明，除第二组大鼠（E+P+S，术后康复1周）的PRL浪潮外，羊骨酶解物对类固醇替代诱导产生的其他LH和PRL浪潮都产生影响，对LH浪潮起到增强（术后康复1周）或抑制（术后康复

3、3周）作用；对PRL浪潮（第4组，术后康复3周）则表现为抑制作用；但羊骨酶解物对第五组（Grp5）大鼠LH(第二组)和PRL（第四组)分泌的抑制作用弱于E+P+S处理组和。【结论】在摘除卵巢用类固醇替代处理的青春期大鼠中，羊骨酶解物对垂体激素LH和PRL的分泌产生影响；这种影响作用依赖于类固醇激素并受到性腺类固醇激素缺乏时间长短（卵巢摘除后康复时间）的调节；羊骨酶解物对LH和PRL分泌的调节可能通过不同的机理，作用于下丘脑则促进或抑制LH的分泌，作用于垂体则抑制PRL的分泌；可能是羊骨酶解物中高含量的精氨酸以及兴奋性氨基酸（谷氨酸和天门冬氨酸）赋予了羊骨酶解物上述对垂体激素的调节功能；羊骨酶解

4、物中可能含有雌激素样的功能性生物活性肽；对上述推测需要进一步实验论证。关键词：羊骨胶原肽；促黄体素；催乳素；类固醇替代 ；去卵巢大鼠Effect of sheep bone collagen peptides and steroids replacement on pituitary hormone release in ovariectomized peripubertal ratsAbstract 【objective】The study in this chapter was designed to investigate the role of sheep bone enzymatic

5、 lysates or sheep bone collagen peotides in mediating steroid-induced luteinizing hormone（LH） and prolactin （PRL）surges in ovariectomized, peripubertal female rats.【Methods】The experiment was carried out on 6-week-old peripubertal female rats of Sprague Dawley strain prior to vaginal opening. All ra

6、ts were ovariectomized bilaterally, and steroid replacement（E+P） was carried out after one week （Grp 1） or three weeks （Grp 3） of ovariectomy. Grp2 and Grp4 were administrated with sheep bone collagen peptides while steroid replacing（E+P+S）.Grp5 were administrated with sheep bone collagen peptides t

7、he day of ovariectomy pro and steroid replacement was carried out after 3 weeks of overiectomy. The procedure of steroid replacement is that on the first day of experiment(day 1) gave the rats 17-estradiol (50mg/kg)by subcutaneous injection（sc）, on the 3rd experiment day（day 3） rats received progest

8、erone（2.5 mg/kg, sc）. The day after the estradiol injection（day 2）, indwelling jugular catheters were surgically implanted in each rat. Sheep bone collagen peptide were intragastrically administrated everyday at a dosage of 1000mg/kgd . All the blood samples were collected through the previously imp

9、lanted jugular cannula on the 1st ,8th , 12th , 16th ,20th ,28th and 36th day since estradiol injection pro, that is, administration of sheep bone collagen peptides pro. The circular concentration of LH and PRL were determined by radioimmunoassay. 【Results】The results suggested that, except PRL surg

10、e produced by rats of Grp 2 (E+P+S, recovered for 3 weels) was not affected, all the steroid-induced LH surges and PRL surges were affected by the administration of sheep bone enzymatic lysates. LH surges were enhanced (1-week recovery)or inhibited(3-week recovery);PRL surge was suppressed in Group

11、4 rats in which group recovered for 3 weeks after the surgical operation. The inhibitive role of sheep bone collagen peptides in Grp5 was weaker than all the E+P+S treatment groups, LH surge in Grp2 and PRL surge in Grp4. 【Conclusions】 In the ovariectomized, steroid replacement treated peripubertal

12、female rats, sheep bone could affect the secretion of pituitary hormone LH and PRL; but the stimulatory effects of sheep bone collagen peptides was steroid-dependent and related to the duration of steroid hormone depletion(recovery time after ovariectomy); There might be different modulation mechani

13、sms of sheep bone collagen peptides for the secretion of LH and PRL; The action on the hypothalamus promote or suppress the secretion of LH, and the action of the pituitary inhibit the secretion of PRL; The above regulatory roles might be conferred by the high amount of arginine and excitatory amino

14、 acids such as glutamate and aspartate contained in the sheep bone enzymatic lysates; and it is tempting to speculate that there might be estrogen-like functionally bioactive peptides in the mixture of sheep bone collagen peptides.Key words: sheep bone collagen peptides; luteinizing hormone; prolact

15、in; steroid replacement; ovariectomized rats综述部分1. NO对垂体激素分泌的影响自从发现NO是一种内源性细胞信号分子以来，关于其产生及作用机理的研究迅速大量开展。 NO是一种内源性的气态神经传递物质（neurotransmitter），由L-精氨酸在一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase NOS）的作用下形成(Bredt 1999)1，是NO合成酶氧化L-精氨酸形成L-citrulline中的产物。有两种类型的NOS，一种是固有酶，即Ca2+-钙调蛋白-依赖性酶；另一种是诱导酶，非Ca2+依赖性酶2,3。 固有性NOS位于下丘脑

16、区域，参与LHRH的释放3,4，因此NO极有可能参与排卵前以及类固醇诱导的LHRH浪潮。不同的实验结果都表明用NMDA刺激EAA受体可促使NO释放5,6，NO或者使突触后泡释放神经递质/神经调节物，或者充当一个倒退信使（a retrograde messenger）激发突触前端进一步释放兴奋性氨基酸。不同的刺激物可对NO合成酶的活性独立调节。NO一旦生成，便可与不同的金属、硫醇（thiols）、和氧结合来修饰蛋白质、DNA和脂类而引起许多的生物效应。NO的典型生物学作用之一便是与可溶性鸟苷酸环化酶 (soluble guanylyl cyclase，sGC)这种异二聚体酶中的亚铁血红素亚基结合

17、，活化sGC，而产生第二信使分子cGMP（3,5-cyclic guanosine monophosphate），cGMP可对许多生理过程进行调节，例如血管扩张、神经传递等7（Krumenacker J et al. 2004）。 Brunetti L等人的研究结果表明，一氧化氮（nitric oxide ，NO）在体外能够调节下丘脑和垂体前叶体外培养细胞CRH 和促肾上腺皮质激素（ACTH）的释放8。他们随后的实验证实了NO参与了PRL基础水平和白细胞介素-1 （interleukin-1 beta-induced）诱导的PRL释放。 NO合成酶抑制剂L-NG-nitro-arginine，

18、以及具有清除NO作用的血红蛋白（hemoglobin）， 使PRL基础水平和平和白细胞介素-1 诱导的PRL减少，而NO供体吗斯酮胺(Molsidomine)却能使PRL释放增加，因而证实了NO在垂体激素释放过程中的调节作用。NO可刺激LH释放和GnRH神经元合成 (Wang et al. 1998) 9和分泌 (Bonavera et al. 1993) GnRH10，可能在类固醇诱导产生LH分泌浪潮的过程中发挥作用(Bonavera et al. 1993, 1994, Aguan 1996) 10-12。Wang等人研究了NO对GnRH mRNA表达的影响，实验结果表明，NO对GnRH的

19、合成和分泌都具有促进作用，由于NO对多巴胺起负调节作用，因此NO促进GnRH mRNA 的表达可能不是通过TIDA（ tuberoinfundibular dopamine）神经元介导的（Wang et al. 1998）9。NO可能在雌激素作用于下丘脑的过程中发挥调节作用。NO通过影响第二信使例如环磷酸鸟苷（cyclic GMP）的功能而作用于目标神经元(Krumenacker et al.2004,Dawson & Snyder 1994)7,13。如果GnRH分泌神经元周围的神经元为一氧化氮合成酶阳性，这就意味着NO对GnRH神经元进行着调节(Bredt 1999,Grossman et

20、 al. 1994, Bhat et al. 1996, Herbison et al. 1996)1,14-16。NO可刺激催乳素释放，在下丘脑正中隆起（median eminence）中，NO抑制多巴胺能神经元（dopaminergic neuron）活性(Yen & Pan 1999)17，然而NO在类固醇诱导产生催乳素过程中发挥的调节作用还不清楚。而在Jill M Russell（2005）18的研究结果中，精氨酸（NO）对PRL的释放或者不影响，或者抑制。这也与本文羊骨酶解物对PRL分泌的影响是一致的。Bonavera (1993、1996) 10,19和Brann（1997）20证

21、实了在成年动物中类固醇诱导LH浪潮中NO的调节作用，A M Brown等（2004）首次报道了L-精氨酸补充可显著增加青春期卵巢切除大鼠LH浪潮的幅度21。但是NO的促进作用依赖于类固醇，因为在类固醇缺乏3周后，NO实际上减少和缩短了LH浪潮的幅度和半衰期。本文羊骨酶解物对LH 分泌的促进作用也依赖于类固醇，类固醇缺乏3周后，羊骨酶解物事实上也减小了LH浪潮的幅度和持续时间。但与Jill M Russell（2005）18的研究结果相比，羊骨酶解物对LH分泌的抑制作用不如精氨酸强。LH对精氨酸应答减弱的一个可能解释是：雌激素缺乏时间越长，NO合成酶的敏感性越低。McCann等人报道雌激素可增强

22、下丘脑NO合成酶的活性22,23（McCann et al. 1998, Gouveia & Franci 2004）和基因表达24（Sahu 1998），雌激素也会增加垂体中NO合成酶的活性和蛋白水平(Garrel et al. 1998)25。因此，长时间缺乏类固醇后，NO合成酶的活性和/或水平可能已经降低。LH对L-精氨酸应答降低的第二种可能的解释是：随着动物的成熟，NO合成酶水平下降。据报道NO合成酶的基因表达的减少与年龄增长有关，但这种情况发生在中年大鼠中24(Sahu 1998)。由于本研究所使用的大鼠为青春期大鼠，因此LH对NO应答的降低不可能是由于年龄引起的。2.兴奋性氨基酸与

23、生殖激素2.1兴奋性氨基酸及其组成兴奋性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）是指具有2个羧基和1个氨基的酸性游离氨基酸包括谷氨酸（Glu）、天门冬氨酸（Asp），是中枢神经系统的兴奋性神经递质，尤其谷氨酸是中枢神经系统含量最高、分布最广、作用最强的兴奋性神经递质。正常情况下兴奋性氨基酸主要存在于神经末梢的突触囊泡内，末梢去极化时释放到突触间隙，作用于突触后膜的特异性受体，完成兴奋性突触传递及其它生理作用。然而过量的兴奋性氨基酸对神经系统具有神经毒性作用,即兴奋性毒性作用。 过去十年中，人们对内分泌系统和神经系统之间相互作用的信号途径的理解，取得了显著进展，其中最重要的

24、进展便是近来人们认识到了谷氨酸在控制脑部功能过程中所发挥的神经递质作用。由于谷氨酸在脑部神经突触中的广泛分布以及在中枢神经系统（ central nervous system ，CNS)存在大量的谷氨酸受体，谷氨酸被认为是体内许多生理过程的中枢调节因子(Refs. 16, for review)。在下丘脑中，由于许多负责繁殖与内分泌的神经核中存在谷氨酸受体，人们推测兴奋性氨基酸（excitatory amino acids，EAAs）在繁殖与内分泌活动中发挥了关键的调节作用，包括青春期发育，促性腺激素的释放，繁殖行为以及应急26。兴奋性氨基酸神经传递系统极其复杂，由23种以上的受体蛋白，4种转

25、运蛋白以及一些可能的内源性配体所组成。然而正是由于这种多样性，决定了兴奋性氨基酸神经传递系统能够履行中枢神经系统中不同的调节作用。EAA神经传递系统的各种组分如图3-1 所示26。 图3-1 兴奋性氨基酸系统的各组成成分示意图26Fig 3-1 Schematic diagram of exitatory amino acid(EAA) system在中枢神经系统中，现有的研究证据表明谷氨酸是兴奋性突触传递的主要介质27-32。谷氨酸储存在突触前端的突触泡中，以依赖于Ca2+的去极化方式释放。据报道在突出间隙谷氨酸的浓度可达到mM水平33,34。2.2兴奋性氨基酸浓度变化与类固醇激素的关系尽管

26、研究不断深入，但控制EAA从突触末端释放的特异性因子人们还知之甚少。好多实验室在探索内分泌信号的可能性，例如类固醇激素可能就是控制EAA从下丘脑释放的重要因子，神经内分泌学家对这个推测颇感兴趣，因为这将是阐述类固醇激素诱导下丘脑释放GnRH的可能机理，进而也将是解释排卵前LH浪潮产生的原因。Ping等就支持卵巢类固醇激素控制下丘脑EAA的释放的假说，因为在摘除卵巢的成年大鼠中，雌激素和孕酮替代处理35小时后就能显著增强下丘脑视前区(preoptic area，POA)谷氨酸的释放35。同时另一种兴奋性氨基酸天门冬氨酸（Aspartate）在视前区的释放也增加。这就意味着神经递质释放的变化，而不

27、是代谢变化引起了谷氨酸释放的变化。由于视前区谷氨酸的释放速率的增加就发生在LH峰值水平出现之前，因此推测兴奋性氨基酸释放的增加是GnRH分泌神经元活化所必需的。Jarry et al. 的研究也表明下丘脑视前区谷氨酸和天门冬氨酸释放速率在雌激素诱导产生LH浪潮时增加34。类固醇诱导的谷氨酸和天门冬氨酸释放的增加似乎只发生在视前区，因为Jarry等35的研究结果显示在雌激素诱导LH浪潮的时候，在下丘脑mediobasal没有检测到谷氨酸或天门冬氨酸浓度的变化。在青春期下丘脑EAA水平也被证实升高，Goroll et al.36证实青春期雌性大鼠，视前区谷氨酸和天门冬氨酸的释放速率增加。因此有理由

28、推测所观察到的下丘脑EAA释放速率的增加是由于青春期血液中卵巢类固醇水平变化所引起的。但在得出明确的结论之前，还需要深入研究EAA浓度的变化是由于类固醇变化还是由于其他一些与青春期相关因子索引起。2.3类固醇激素和发育变化对下丘脑兴奋性氨基酸受体的调节中枢神经系统中，兴奋性氨基酸受体是数量最多的神经递质受体27,28 , 31,39。兴奋性氨基酸受体也被称为谷氨酸受体（glutamate receptors），因为尽管还有其他配体存在，但谷氨酸被认为是主要的内源性配体。目前已经鉴定的受体有两种：一种是离子型（ionotropic，100,000 Da），另一种是代谢型（metabotropic

29、）。离子型受体包含完整的阳离子特异性离子通道，代谢型受体与G蛋白偶联调节第二信使的产生。离子型受体有N-methyl-D-aspartate (NMDA)受体, 2)海人酸（kainate）受体,和3) AMPA （DL-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) 受体。离子型受体的活化直接导致离子通道的开放，这些离子通道对 Na+， K+ 以及Ca2+具有不同的渗透性。代谢性受体则不活化离子通道，以G蛋白刺激Ca2+从细胞内释放为特征来调节腺苷酸环化酶（adenylate cyclase）的活性32,39, 40。因此代谢型受体通

30、过调节第二信使系统而对神经突触起到长久的调节作用。人们推测类固醇激素可能会上调EAA受体在下丘脑中的浓度，进而增强了谷氨酸的神经传递作用。这种推测为类固醇激素水平很高时，可促进GnRH神经元活化提供了一种可能的机理。Brann 等 41,42以雌性大鼠为实验动物发现用雌二醇或孕酮急性或慢性处理都不会影响NMDA受体的结合以及NMDA-R1的mRNA水平。同样用睾丸激素处理雄性大鼠也对NMDA受体的结合以及NMDA-R1的mRNA水平没有产生影响。相似地，Kus等43用原位杂交技术在特异性下丘脑神经核中检测mRNA转录本，发现去势和二氢睾酮处理对雄性成年大鼠NMDA-R1 mRNA水平也没有影响

31、。另一方面，Weiland44发现，雌二醇和孕酮处理可导致3H标记的谷氨酸在下丘脑视前区的结合量增加，并且这种结合量的增加是由于非-NMDA受体位点的增加所引起。Brann和Mahesh45的的发现为Weiland的实验结果提供了证据支持，他们在未成年雌性大鼠中发现，雌二酮和孕酮处理增加了视前区（POA） 和中文名臣ARC 中AMPA受体的GluR1亚基的水平，表明谷氨酸受体（GluR1）数量增加。Diano等46也报道了雌二醇处理后，用免疫组化技术检测到成年雌性大鼠下丘脑中的GluR1 和GluR23水平上调。因此，可以得出如下结论：当下丘脑NMDA受体没有受到类固醇激素调节的时候，下丘脑A

32、MPA受体水平就会受到雌二醇和孕酮的调节。目前，类固醇是否对兴奋性氨基酸其他受体即海人酸（kainate）受体或代谢型受体进行调节的研究还没有人开展，同样，人们也不知道在下丘脑中拥有EAA受体的细胞类型。Bhat等47近来报道在雌性大鼠，NMDA-R1受体位于许多下丘脑神经核中的NO神经元中。2.4 谷氨酸是下丘脑中主要的兴奋递质（excitatory transmitter）应用谷氨酸、天门冬氨酸、L-homocysteic acid可以使下丘脑ARC，ME以及其他受试medial hypothalamic locations区域的神经元兴奋48。van den Pol等也证实对谷氨酸、天门冬氨酸、海人藻酸（kainate）以及NMDA产生应答的神经元，细胞内的Ca2+浓度增加并参与细胞内的诸多生化过程49。众多研究表明下丘脑神经核中的兴奋性氨基酸受体是功能性的，并且谷氨酸是下丘脑突触活化的主要调节因子49。2.5 谷氨酸可刺激垂体LH的分泌1976年Olney50和 Ondo51实验室首先证明了谷氨酸可刺激LH分泌。他们用系统性的皮下注射和第三脑室注射给药途径，在成年雄性大鼠中谷氨酸可显著增加LH的释放，而对FS