AB7500荧光定量PCR仪使用维护校准标准操作规程.docx

1、AB7500荧光定量PCR仪使用维护校准标准操作规程AB7500荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程(总21页)文件名称AB7500荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程使用维护标准操作规程颁发部门制订人： 复核人： 批准人： 质保部制订日期：复核日期：批准日期：执行日期版本1.0编号SOP04006制作份数_份发送部门修订记录修订人修订原因修订内容版本修订日期1.目的：确保荧光定量PCR仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。2.范围：适用于AB7500荧光定量PCR仪的使用及维护。3.定义：无4.职责：荧光定量PCR仪使用人员负责本规程的实施。质保部对本规

2、定的有效执行承担监督检查责任。5.内容：5.1 室内温度控制在1530，相对湿度4575%。5.2 仪器操作5.2.1 依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows界面。5.2.2 接着打开AB7500仪器电源开关，预热10分钟。5.2.3 点击7500 Software v2.3图标，打开软件。5.2.4 按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测的8联PCR反应管或者96孔PCR反应板放入检测孔位，记下放置位置。检测8联PCR反应管用*反应孔模块，检测96孔PCR反应板用*反应孔模块。（检测8联PCR反应管需放入盖紧管盖的空8联PCR反应管配平，检测96孔PCR反应板无

3、需配平）5.2.5 再次按压托盘使其滑入仪器。5.2.6 新建扩增参数模板：例如新建一个UG-63-62的模板，扩增参数是95，10；（95，10；63，45）5 cycles；（95，10；62，35）40 cycles，在62时收集荧光信号（HEX、FAM信号），20l反应体系。5.2.6.1 在Setup-Plate Setup-Define Targets and Samples中，将Target Name下的Target1改成FAM；点击Add New Target，将新增的Target1改成HEX，点击Reportee下拉菜单，选择VIC。5.2.6.2在Setup-Run Met

4、hod-Graphical View中的Reaction Volume Per Well后面输入20（20l反应体系）。选中第一个Holding Stage，点击Delete Selected删除；在Cycling Stage中的Number of Cycles后输入5，在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度63度，输入时间45秒，将63度下面收集荧光图标点掉；点击Add Stage下拉菜单选择Cycling，在Cycling Stage中的Number of Cycles后输入40，在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度62度，输入时间35秒，在62度下面点击图标

5、收集荧光。3 点击Save下拉菜单下的Save As Tamplate，文件名输入UG-63-62，保存在默认ab7500-config-tamplates文件夹内，关闭设置界面。5.2.7 已有扩增参数模板：在软件Home界面中点击Template，选择需要的模板，点击打开。例如：UG-63-62，其扩增参数就是95，10；（95，10；63，45）5 cycles；（95，10；62，35）40 cycles，在62时收集荧光信号（HEX、FAM信号），Reaction Volume Per Well:20l（20l反应体系）。5.2.8 在Setup-Plate Setup-Assign

6、 Targets and Samples中选择8联管摆放的位置，全部勾选Sample 1；UGT1A1*6勾选HEX，UGT1A1*28勾选FAM。5.2.9 在Run-Amplification Plot中点击START RUN，命名为（当日日期+当日上机次数，例:2014年1月1日第1次上机编号为），保存在默认文件夹中，开始运行。PCR反应结束后自动保存结果，对扩增曲线进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在315、End值可设在520），Threshold值（Rn）推荐设定为500015000，点击Analyz

7、e进行分析，然后到Plate窗口下记录每个反应的Ct值。实验结束后取出反应管（切勿打开管盖），顺序关闭AB7500软件、定量PCR仪电源，关闭电脑。5.3 仪器维护5.3.1 每周维护检查计算机磁盘空间。如需要，将实验文件归档或备份。 至少每周检查一次计算机磁盘空间。 如果硬盘的可用空间不足其总容量的20%，应将较陈旧的数据传输到备份存储设备上保存。 关闭控制7500 Instrument的计算机，30秒后再次开启计算机。 用无绒布块（不脱毛）蘸取75%酒精清洁7500 Instrument的表面。（注：切勿使用有机溶剂清洁7500 Instrument。）使用75%酒精浸泡反应管托架（晾干后

8、放回仪器内）。5.3.2 每月维护执行背景校准。（可执行一次背景校准以检查是否存在污染物） 运行磁盘清理和磁盘碎片整理。 至少每月一次。 当Windows操作系统显示消息提示执行碎片整理时。 切勿同时运行磁盘管理实用工具和7500 Real-Time PCR Software。5.3.3 每半年（6个月）维护1 检查灯具状态。在7500 Software中，选择InstrumentLamp Status/Replacement以确定卤素灯的状态。显示Lamp Status/Replacement对话框： Condition 表示以下其中一种状况： Good 灯具工作良好，不需要更换。单击Clo

9、se。 Failed 必须更换灯具。单击Close，然后按照步骤更换卤素灯。 Change Soon 灯具使用超过2000小时；生产商建议将其更换。单击Close，然后决定是否更换灯具。如果决定更换，请按照步骤更换卤素灯。 Usage (Hours) 灯具已照明的总小时数。 Lamp Current 灯具的输出电流，以安培为单位(A)。低电流意味着灯具可能将要失效。 Date Last Replaced 上次更换灯具的日期。在执行一次运行之前或期间，7500 Software可能显示以下警告：消息描述Warning Cannot detect sufficientcurrent from la

10、mp. Either lamp is notinstalled properly or needs to bereplaced.在运行开始时，灯具电流低于可接受水平。在按照步骤更换卤素灯具之前，无法继续该运行。Warning Cannot detect sufficientcurrent from lamp. Either lamp is notinstalled properly or needs to bereplaced.7500 Software停止了该次运行，因为在运行中灯具电流下降到可接受水平之下。在按照步骤更换卤素灯具之前，无法继续该运行。在消息框中单击OK，检查仪器日志，然后更

11、换灯具。Warning - The lamp usage hasexceeded 2000 hr. We recommendreplacing the lamp soon to ensure optimal assay performance.在运行开始时，灯具使用时间超过2000小时。单击Cancel Run，然后更换灯具，或者单击Continue Run。重新运行ROI、背景、光学和染料校准。执行目标区（ROI）校正。执行背景校准。执行光学校准。执行染料校准。执行RNase P仪器验证试验。5.3.4 其它维护任务（需要时执行） 样本块污染清除。 执行以下程序，去除7500 Instrum

12、ent样本块的荧光污染。荧光污染是导致背景运行失败的常见原因，在此情况下，一个或多个反应孔会持续表现出异常的高信号。注意！切勿移去设备上的盖板。7500 Instrument中没有用户可安全维修的组件。如果怀疑存在问题，请联系生产商服务代表。 全程戴上一次性无粉手套操作。找到样本块中受污染的反应孔（参阅“如何确定污染”）。从7500 Real-Time PCR Instrument中取出反应板和托盘支架。a.按压托盘门，将其打开。b.取出反应板和托盘支架。c.关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。手动降低样本块：a.在7500 Software中，选择 InstrumentInstrume

13、nt Maintenance Manager。b.在Instrument Maintenance Manager的ROI选项卡中，单击Start Manual Calibration。c .在ROI Inspector对话框中，单击Move Block。d.当ROI Inspector对话框显示“Block Down”时，单击Done。关闭7500 Real-Time PCR Instrument，然后拔下其电源电缆。允许仪器冷却15分钟。打开7500 Real-Time PCR Instrument的检查门。a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。b.打开仪器前门。抬

14、起门栓，然后将受热的护盖门推到仪器的背面。使用少量的双蒸水，清洁样本块中被污染的反应孔：a.用移液管吸取少量双蒸水并滴入每个受污染的反应孔中。b.抽吸并滴入反应孔中的双蒸水数次，以冲洗反应孔。c.将用过的双蒸水水吸入废液瓶中。d.使用棉花拭子，擦试每个被污染的反应孔的内壁。e.使用无绒布料，吸出残余的双蒸水。7500 Real-Time PCR Instrument将受热的护盖门拉到仪器的正面。抬起门栓，然后将受热的护盖门紧固到交叉杆。打开7500 Real-Time PCR Instrument的检查门。插上电源插头并开启7500 Instrument。通过执行背景校准运行确认已消除污染（参

15、阅5.4.2 “背景校准”）。如果污染仍然存在，重复步骤至，然后使用95%乙醇溶液清洁样本块中受污染的反应孔：a.用移液管吸取少量95%乙醇溶液并滴入每个受污染的反应孔中。b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。c.将用过的乙醇溶液吸入废液瓶中。重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用双蒸水冲洗反应孔。重复步骤至，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。如果污染仍然存在，重复步骤至，然后使用10%漂白剂溶液清洁样本块中受污染的反应孔：a.用移液管吸取少量10%漂白剂溶液并滴入每个受污染的反应孔中。b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。c.将用过的漂白剂溶液

16、吸入废液瓶中。重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用去离子水冲洗反应孔。重复步骤至，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。如果仍有污染，请与生产商技术支持联系。确保受热盖门完全关闭并上闩。如果没有，则7500 Software显示错误消息。2 移动PCR仪。（更换或移动光学器件的任何部件后，必须执行ROI校准、背景校准、光学校准、染料校准以及RNase P仪器验证。）3 更换卤素灯。全程戴上一次性无粉手套操作。关闭7500 Instrument，然后拔下其电源电缆。允许仪器冷却15分钟。a.注意！灼热。7500 Instrument和灯具灼热！灯具在使用中会变得非常灼热

17、。在处理灯具之前，应允许灯具冷却15分钟，并戴上无粉防护手套。b.重要！为避免灼伤及缩短新灯具的使用寿命，处理灯具时请戴上一次性无粉手套。c.注意！7500 Instrument按设计仅可使用12V、75W的卤素灯。打开 7500 Instrument 的检查门。a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。b.打开仪器前门。从仪器中取出灯具：a.向下滑动灯具释放杆。b.用手紧紧地抓住卤素灯并向上提，使灯具从安装槽口中脱出。a b查看灯具并确定有无故障迹象（有故障的灯具内壁上通常有碳黑层）。将新灯具安装至仪器上：a.向上滑动灯具释放杆。b.用手紧紧地握住灯具，将灯具放入带槽口

18、的安装座内，然后小心地向下滑动灯具，使其到位。关闭仪器前门。插上电源插头并开启7500 Instrument。打开 ROI Inspector对话框：a.在 7500 Software 中，选择 InstrumentInstrument Maintenance Manager。b.在Instrument Maintenance Manager的ROI选项卡中，单击Start Manual Calibration。在ROI Inspector对话框中，选择Lamp ControlIdle。当仪器运行时，通过检查门上的缝隙观察，确保灯具发光，然后单击Done。如果灯具发光，在7500 Softwa

19、re中选择InstrumentLamp Status/Replacement，单击Reset Lamp Timer，然后单击OK。如果灯具不发光，则替换的卤素灯可能有缺陷。重新更换灯具。如果再次更换灯具后仍不发光，检查仪器的保险丝是否存在故障（参阅第 71 页）。更换灯具后，按顺序执行以下校准。请参阅： 5.4.1 目标区（ROI）校准 5.4.2 背景校准 5.4.3 光学校准 5.4.4 染料校准 5.4.5 验证仪器性能4 更换7500 Instrument保险丝。保险丝损坏时，更换7500 Real-Time PCR Instrument保险丝。（注意！为在长时间内防止火灾，更换保险丝

20、时请使用类型和额定值与仪器原始保险丝相同的经认可的保险丝。）全程戴上一次性无粉手套操作。关闭仪器电源，并拔下电源插头。使用平口螺丝刀从仪器上旋松并卸下保险丝座。将每一个保险丝从其保险丝座中取出，然后检查是否损坏。损坏的保险丝内部通常有炭黑覆盖。使用12.5A、250V、520mm保险丝更换损坏的保险丝。注：电压和电流额定值见保险丝座。安装保险丝座。插上电源插头，然后开启仪器。如果仪器接通了电源，说明保险丝已安装成功。注：保险丝损坏可能是由仪器供电电源波动导致。为了防止继续出现故障，可以考虑安装电气保护设备，例如UPS或其他电涌保护器。5 更新Windows操作系统。更新7500 Softwar

21、e。7 监控仪器状态（使用Function Test对话框对主要7500 Instrument组件执行高级诊断。一般情况下不需要执行功能测试，除非怀疑有硬件故障，或者Life Technologies代表指示这样做。）在7500 Software中，选择InstrumentFunction-Test。根据需要执行功能测试。要测试：所有组件单击All Tests，然后等候软件执行所有功能测试。一个或多个特定组件单击以下其中一项或多项。 USB测试 7500 Real-Time PCR Instrument和计算机之间的通用串行总线(USB)连接。如果7500 Software能够和7500 Re

22、al-Time PCR Instrument建立通信，则表示测试通过。 CCD测试7500 Real-Time PCR Instrument内的CCD摄像机。如果摄像机能够拍摄图像，则表示测试通过。 Filter Wheel测试7500 Real-Time PCR Instrument内的过滤轮。如果过滤轮控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。 Shutter测试7500 Real-Time PCR Instrument的光学快门。如果快门控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。 Lamp测试7500 Real-Time PCR Instrument的卤素灯。如果灯具控制器运行正确版本的

23、固件，则表示测试通过。 Thermal Cycler测试7500 Real-Time PCR Instrument内的热循环仪样本块。如果热循环仪的控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。当7500 Software完成一项测试时，软件报告该测试的通过/失败状态，并提供结果描述。结束测试时，单击Close。5.4 仪器校准5.4.1 目标区（ROI）校准5.4.1.1 全程戴上一次性无粉手套操作。5.4.1.2 从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出ROI校准反应板。5.4.1.3 让ROI校准反应板温度上升至室内温度（约需5分钟）。在立即运行反应板之前，不要从包装袋内取出ROI校准反应板。反

24、应孔中的荧光染料具有光敏感特性。长时间曝光可降低染料在反应板中的荧光。5.4.1.4 从包装袋中取出ROI校准反应板。将光学薄膜留在反应板上。不要丢弃存放ROI校准反应板的包装袋。若贮存于原始包袋中，反应板最多可重复使用三次。5.4.1.5 振荡ROI校准反应板5秒钟。5.4.1.6 用板式离心机将反应板离心2分钟。ROI校准反应板必须充分混合并离心。5.4.1.7 确认ROI校准反应板每个反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更高的转速及更长的时间离心反应板。5.4.1.8 按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正确对齐。（装入标准反

25、应板，使A12凹口位置位于托盘的右上角。）5.4.1.9 以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。5.4.1.10 执行自动ROI校准 在7500 Software中，选择InstrumentInstrument Maintenance Manager。 在Instrument Maintenance Manager的ROI选项卡中，单击Start Calibration。 按照向导的指示，完成校准。ROI Calibration对话框显示三个选项卡： Setup显示ROI校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。 Run单击START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单

26、击Next提示可以打开Analysis选项卡。 Analysis指明校准状态（Passed/Failed）。如果校准失败，请参阅“排除ROI校准故障”。5.4.1.11 执行手动ROI校准 在7500 Software中，选择InstrumentInstrument Maintenance Manager。 在Instrument Maintenance Manager的ROI选项卡中，单击Start Manual Calibration。 在ROI Inspector对话框中（如图1）：a.在Exposure Time字段中，输入2048。b.选择Filter A（滤光器1）。图1 单击Sn

27、apshot，生成一张ROI图像。 确定ROI图像是否可接受（下图所示为未饱和以及过饱和的图像）。可接受图像中的反应孔： 在不过饱和的前提下，必须尽可能明亮。（生成ROI校准时，如果反应孔过饱和，则显示一条警告。） 可以含有但不是必须含有红色像素（表示饱和）。未饱和正常饱和过度饱和可接受不可接受 如果ROI图像可接受，转至步骤。如果ROI图像过饱和，将Exposure Time降低一半，然后单击Snapshot。重复执行，直至获得可接受的ROI图像。如果无法获得可接受的图像，请参阅“排除ROI校准故障”。 单击Generate Calibration。7500 Software采集一张截图，然

28、后显示一个消息框或ROI图像：如果软件显示：执行：或a. 单击OK。b. 将Exposure Time降低一半（参阅5.4.1.11步骤a）。c. 重复步骤和。ROI 图像非常模糊或者无法成功校准。请参阅“排除ROI校准故障”。可接受的校准图像注：在所有反应孔周围出现绿色圆圈，表示反应孔成功校准。注：绿色圆圈表示反应孔位置的目标区已足够亮。验证以下各项：Wells Found值为96。成功校准Wells Found必须为96。在ROI图像上每个反应孔区的周围显示绿色圆圈。 单击Save Calibration。软件保存滤光器1新产生的ROI校准。在ROI Inspector的Filter Ma

29、sks Loaded区域，“OK”出现在滤光器1旁边。 对其余滤光器重复步骤至，对每个滤光器执行校准之前，将Exposure Time重置为 2048。当所有滤光器的Filter Masks Loaded都显示OK时，ROI校准完成。当所有滤光器的Filter Masks Loaded都是OK时，校准完成。 点击 Done。拆卸反应板（注意！灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过100C。若刚使用过仪器，在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。）取出校准反应板：a.按压托盘门，将其打开。b.取出校准反应板。c.按压托盘门，将其关闭。将校准反应板放入其包装套中。如果要执行背景和光学校准：a.在接

30、下来的8小时，将ROI校准反应板置于室温下。光学校准使用ROI校准反应板。b.第二天将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。c.重要！不要丢弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在打开其包装后最多可重复使用反应板3次。d.重要！执行ROI校准后，也必须执行背景校准、光学校准、染料校准以及仪器验证。排除ROI校准故障问题/症状可能原因行动ROI 校准失败样本块可能位于降低的位置。1.如果ROI Inspector的CCD Control/Settings显示“Block Up”，则单击Block Up将样本块升高。2.检查确认受热的盖组件已被全程向前拉出，以确保托盘可以被正确推入。如果7500 Instrument安装了受热盖栓，检查确认盖栓处于锁定位置。3.如果ROI校准仍然失败，检查7500 Instrument内的卤素灯状态（参阅“监控灯具状态”），然后，如果需要时，更换灯具（参阅“更换卤素灯”）。ROI 图像模糊5.4.2 背景校准全程戴上一次性无粉手套操作。从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出准备好的背景反应板。让背景反应板温度上升至室温（至少需要5分钟）。从包装袋中取出背景反应板。（重要！不要丢弃存放反应板的包装袋。若将背景反应板