高效液相色谱质谱联用HPLC.docx

1、高效液相色谱质谱联用HPLC液相色谱-质谱联用技术（LC-M0的各种模式探索一、 实验目的1、 了解LC-MS的主要构造和基本原理；2、 学习LC-MS的基本操作方法；3、 掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。二、 实验原理1、液质基本原理及模式介绍液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry , LC- MS将应用范围极广的分离方法一一液相色谱法与灵敏、专届、能提供分子量 和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。但是，LC是液相分离技术，而 MS是在真空条件下工作的方法，因而难以 相互匹配。LC-MS经过了约

2、30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization , API）之后，才发展成为可常规应用的 重要分离分析方法。现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均 得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中， LC-MS已经成为最重要研究方法之一。质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。（一） 全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可 以用来进行谱库检索，一般用于未知化合

3、物的定性分析。实例： （Q1 = 100-259m/z）（二） 选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring , SIM）:不是连续 扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物 的全谱。主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。实例： （Q1 =259m/z）本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1:质量分析器；Q2:碰撞活化室；Q3: 质量分析器），由于多了 Q2、Q3的存在，在分析测试的模式上乂多了四种选 择：（三） 子离子扫描模式（Product Scan ）：第一个质量分析器固定扫描电 压，选择某一质量离子（母离子）进入碰撞室，发生碰撞

4、解离产生碎片离子， 第二个质量分析器进行全扫描，得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生的子离子，没有其它的十扰。主要用于化合物结构分析。实例：（Q1 = 259m/z; Q3 = 100-259m/z）（四） 母离子扫描模式（Precursor Scan ）：第一个质量分析器扫描电压 选择母离子（如分子离子），进入碰撞室碰裂后，第二个质量分析器固定扫描电 压，只选择某一特征离子质量，该特征离子是由所选择的母离子产生的，由此得到所有能产生该子离子的母离子谱。主要用于同系物的分析。实例： （Q1 = 100-300m/z ; Q3 = 259m/z）（五） 中性丢失扫描模式（Neutral Lo

5、ss ）:第一个质量分析器扫描所有 离子，所有离子进入碰撞室碎裂后，第二个质量分析器以与第一个质量分析器相差固定质量联动扫描，检测丢失该固定质量中性碎片（如质量数 15、18、45）的离子对，得到中性碎片谱。主要用于中性碎片的分析。实例： （Q1 =100-300m/z ; Q3 = 82-282m/z ）（六） 多反应监测模式（MRM第一个质量分析器选择一个（或多个）特 征离子，经过碰撞解离，到达第二个质量分析器再进行选择离子检测，只有符 合特定条件的离子才能被检测到，因为是两次选择，比单四极质量分析器的SIM方式选择性、排除十扰能力、专届性更强，信噪比更高。主要用于定量分 析。实例：（Q1

6、 = 259m/z ; Q3 = 138m/z）2、实验内容简介邻苯二甲酸酯（简称PAEs左一类重要的环境内分泌十扰物，常被用作塑料 的增塑剂，也可用作农药载体。近年来，随着工业生产和塑料制品的广泛使 用，邻苯二甲酸酯不断进入环境，普遍存在于土壤、底泥、大气、水体和生物 体等环境样品中，成为环境中无所不在的污染物。据报道，邻苯二甲酸酯类具 有较弱的环境雌激素成分，具有影响生物体内分泌和导致癌细胞增殖的作用。 环境内分泌十扰物是指能改变机体内分泌功能，并对机体、后代或（业）种群 产生有害效应的环境物质。由于环境内分泌十扰物对人和动物有种种不良影响，对环境内分泌十扰物的研究已成为国际关注的焦点。我

7、国也正在逐渐重视 有关环境内分泌十扰物的研究。三、 仪器与试剂1、 仪器液相系统：Varian Pro Star ；自动进样器：Varian 410自动进样器；质谱仪：Varian 310 LC-MS/MS三重四极杆质谱仪(ESI离子源)；色谱柱：Varian Inertsil 3 ODS-3 (150m心 2mm 3 ii而。2、 试剂甲醇：HPLCfe谱纯；超纯水：Millipore Express 超纯水系统制备；标准溶液：用甲醇配制邻苯二甲酸二甲酯 (DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)混合标准溶液(0.1ppm)。四、 实验步骤1、 条件设置色谱条件：流动

8、相(90%ffW +10咻)；流速(0.2ml/min );扫描时间(7min)；离子源模式：电喷雾电离(ESI),正离子模式；扫描条件：Detector : 1000V； Needle : 5000V； Shield : 600V； Spray Chamber Temperature : 50 C； Nebulizing Gas Pressure : 55psi ; Drying Gas Pressure : 18psi , Drying Gas Temperature ( C): 250 C , Capilary Voltage 30(V) , Coll.Energy 30(v);质量分析

9、器：三重四极杆；进样体积：10ul。2、 实验测定按实验操作规程完成仪器开机、参数设置及测定。根据表1中的数据，设置 m/z,选择各种扫描模式(全扫描、选择离子扫 描、子离子扫描、母离子扫描、多反应监测模式)进行测定。3、数据处理表1待测物质的母离子和主要子离子DMPDEPDBP母离子195.1223.1279.1(m/z)子离子163.1149.1149.1（m/z）（一）全扫描模式方式（Scan）:MCotntS 疝4CH 主MCounts1D0.0-3303-3S-22 PH9-20-2O10-&l：Bl. wms 100 0.330.0 Filtered I100.0:330.1

10、 3-38-22 PM-S-20-201 D-sample1.xms 217.0 (100.0:330.0) Filtered 叵田)3-驴-安 PM- 20IO-samfll9l 223 (IDO 0:330 Ffltered100.0.3301125-W.0-7.52.5-CI.CHM Count sS/N (RMS): 230S: 27如祐06N： 119692.5 , 1 5.0, , 7.5w.o1Z515.0l/5, 1 minutesSegment 1Scansi?r41OFFJr sIons： 2232.01.5- 1.E 0 50.0*1 I卷气 X I密西而吸,SIM):（

11、二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring|寺|卷，X I卜H 昭：盅械I心2Q37 mi。，Scan: 11/Z3.DI RIC： 237如+Spectrum 1A日P 以3.1 (2,37为巧=100%), 34日浦口 |?”9-胡中。1口我mpl1 ,冲$MCcunlS2231芸71A0(H224Acquirsd Range m/z(三)子离子扫描模式(Product Scan )：1+1 | 节吒 X I| rH 迎，底映|Precursor ScanM Counts0 5-15.02.714e+6kCountsz200STM (RMS)： 9.S 206e

12、+006N: 22Q531DH。:迎.O*9.CI2 074 min4-13-21 PM-9-2B-2010-sample1.xms 100.0:350.0149.0 -15.0V Fiftered175minuteS1 1II。呼f IpJ J- sIons：=1 刘 1 节 IT1宵，|昭布秋1Spectrum 1A日户：2为.3 何38O4D=1CICI构,4-BN1（五）多反应监测模式（MRM-15.0V/n（rm3）： 19“S; 964393N: 5050.7&H0 25-0 00I | OFFfp| |r s lons:1 +IM 戋l 7-1 IT| H T 瓯Cs秋|50MC

13、ounts-Segment 11490 1.04 Fe+6Spectrum 1ABP: 149.CI。一04为那=1口。码，&22-2B #m-9-2&2O1（3-samplG .xms 2俱3 min. Sc如 119,223.CM49U -佑.BV, RfC: L04利西J JJ 10.0 12.6 15.0 17.5minutes7&T1Aosoe日一笙-otx14914915f4、思考题1、各扫描模式中m/z分别如何设定?（一） 全扫描模式方式（Scan）： 100-300m/z;（二） 选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring , SIM）: 279m/z;

14、（三） 子离子扫描模式（Product Scan ）: Q1=279m/z,Q2=100-279m/z;（四） 母离子扫描模式（Precursor Scan ）: Q1=149-300m/z ,Q2=149m/z;（五）多反应监测模式（MRM Q1=279m/z,Q2=149m/z;2、比较各模式的测定结果，讨论各模式在测定中的作用。（一） 全扫描模式方式（Scan）:扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是 化合物的全谱，一般用于未知化合物的定性分析。（二） 选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring , SIM）:跳跃式地扫描某几个选定的质量

15、，得到的不是化合物的全谱。主要用于目 标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。（三） 子离子扫描模式（Product Scan ）：对碰撞解离产生碎片离子，第二个质量分析器进行全扫描，得到的所有碎 片离子都是由选定的母离子产生的子离子，没有其它的十扰。主要用于化合物 结构分析。（四） 母离子扫描模式（Precursor Scan ）：第一个质量分析器根据某一特征离子质量扫描电压，确定该特征离子是由 哪种所选择的母离子产生的，由此得到所有能产生该子离子的母离子谱。主要 用于同系物的分析。（五） 多反应监测模式（MRM比其他模式更具有排他性、排除十扰能力、专届性更强，信噪比更高。主 要用于定量分析。3、结合HPLC等其它色谱分析技术及实验，讨论 LC-MS的优势及在社会中所能起到的作用。答：应用广泛，既能分离物质还能作精确分析，而且分析速度快，分离效率高，自动化等特点。但表面活性剂不能进去，不能测无机离子。可用于食品检测，药物杂质的质控等！