1、基于表面增强拉曼技术的DNA循环放大生物传感方法的研究硕 士 学 位 论 文MASTER DEGREE THESIS基于表面增强拉曼技术的DNA循环放大生物传感方法的研究基于表面增强拉曼技术的DNA循环放大生物传感方法的研究摘 要 本文主要做了以下几个方面的工作:一是基于表面增强拉曼光谱(surface enhanced Raman scattering spectrum, SERS)检测技术构建了一种新型的DNA循环放大方法,利用DNA酶和目标分子结合后独特的共反应催化剪切活性,实现了高灵敏度检测小分子物质L-组氨酸的方法。二是将纳米金粒子上分别修饰Rox分子和Cy3分子,制备了具有SERS
2、活性的两种纳米金生物条码,基于表面增强拉曼散射分析方法,结合靶DNA引发的链替代循环反应,实现了两种目标DNA的同时检测。在此基础上,引入双功能适体探针,实现了ATP和L-组氨酸的同时检测。具体介绍如下: 1. 利用DNA酶替代了传统检测方法中的目标分子识别适体,基于DNA酶与目标分子结合而引发的共反应催化剪切活性释放引发链,进而激发链替代循环反应,结合发卡探针引发的循环放大方法,实现了小分子物质L-组氨酸的高灵敏度检测,检测限达0.74 nM (3)。利用引发链的再循环利用,固定在磁珠上的发卡探针被不断的打开,进而大量的生物条码被固定到了磁珠上,实现了高效的源头信号放大,并通过磁性分离和洗涤
3、,除去过量的纳米金生物条码,降低了检测体系的背景值,从而实现了L-组氨酸的高灵敏度检测,可用于实际样品细胞匀浆中的L-组氨酸的测定。该方法设计较为简单,操作快捷方便,更有广泛的适用性和良好的选择性。2. 利用表面增强拉曼散射技术高分辨率的特性,基于DNA链之间的碱基互补原理,创建了一种新型的电化学检测方法,实现了两种目标DNA的同时检测。以纳米金为增强底物,制备了分别由Rox分子、Cy3分子修饰的两种不同的生物条码探针。在目标DNA存在下,发生引物链增长-替代反应,实现了源头信号放大,使信号显著增强,检测灵敏度显著提高。3. 构建了一种新型的DNA双功能适体链,结合DNA循环放大反应,提出了一
4、种利用表面增强拉曼技术同时检测ATP与L-组氨酸的方法。在金纳米粒子上分别修饰上Rox分子与Cy3分子,得到两种不同的生物条码。利用DNA双功能适体链与两种目标分析物的特异性结合,释放出两条引物链,激发对应发卡探针的循环放大反应,大量的生物条码被固定到磁珠上。最终通过检测固定到磁珠上的生物条码,实现了两种目标分析物质ATP与L-组氨酸的高灵敏度检测。关键词:适体DNA 表面增强拉曼光谱 纳米金生物条码 循环放大BIOSENSING METHOD RESEARCH WITH DNA-RELATED CYCLES AMPLIFICATION USING SERS DETECTION TECHNOL
5、OGYABSTRACTIn this study, a series of SERS signal amplification biosensing methods were developed with high sensitivity, easy operation and good reproducibility. First, a novel SERS method was designed to detect L-histidine based on DNA amplification technique. The DNAzyme as a molecular recognition
6、 module will trigger circular hairpin assisted exponential amplification reaction simultaneously. Second, two kinds of differently modified bio-barcodes were prepared to detect the corresponding two kinds of genes based on autonomous target-displacement polymerization reaction. On this basis, a difu
7、nctional aptamer probe was introduced into the system to detect ATP and lysozyme simultaneously. These SERS biosensing method provides a universal method for quantitative analysis of genes, cells and also proteins, etc, and supplies valuable information for biomedical research.1. A novel SERS method
8、 based on DNAzyme which can specifically recognize L-histidine is demonstrated in this assay to detect L-histidine. It was confirmed that the unmodied DNAzyme had characteristic of endonuclease as long as it combined with the target. In the DNA recycling amplification reaction, a large number of bio
9、-barcodes were indirectly captured on the magnetic beads as the hairpin probes immobilized on the magnetic beads were constantly opened. The problem of high background induced by excess bio-barcodes was solved by magnetic separation. The detection limit of 0.74 nM (3) was gained with the amplificati
10、on of hairpin assisted exponential amplification reaction. Due to its high sensitivity, excellent specificity and good performance in cellular homogenate, it holds great potential for the development of ultrasensitive biosensing platform for the applications in bioanalysis.2. A sensitive SERS detect
11、ion method was developed based on hairpin assisted exponential amplification reaction and used to detect two target DNA simultaneously. The amplification process is accomplished by taking advantage of both two kinds of hairpin assisted exponential amplification reaction. Two different kinds of bio-b
12、arcodes which are modified with Rox and Cy3 respectively were prepared while gold nanoparticles works as the enhanced substrate. The rapid and sensitive analysis of target DNA demonstrated the applealing bioanalytical features of this method.3. On the basis of the above work, we proposed a new metho
13、d for detection of ATP and L-histidine simultaneously. A novel difunctional aptamer which can both recognize ATP and L-histidine was first introduced into ultrasensitive SERS biosensing applications based on the DNA amplification method. Compared with the second experiment, two kinds of trigger gene
14、s were immobilized on the magnetic beads earlier and then released by the recognition of ATP and L-histidine. The two cycles which were independent and happen simultaneously as an effective amplified replication system were triggered. A large number of biobarcodes were immobilized on the magnetic be
15、ads indirectly. With multiple amplification steps and magnetic separation procedures, this new biosensing system exhibits high sensitivity and specificity.KEY WORDS: Aptamer DNA SERS Nano Au biobarcode Amplification 第一章 前 言1生物传感方法生物传感方法自诞生半个世纪以来得到了迅速的发展,同时其在食品安全监测、临床检测、新药的研发等领域具有广阔的研究潜力和应用前景。生物传感方法并
16、不是独立存在的一项科学技术,它与很多学科密切相关,是现代先进生物技术与化学、物理学、环境科学、生命科学、材料科学等诸多学科相互融合共同组成的,且在很多科研领域有着不可替代的作用。近些年来,化学、材料科学、环境科学、生物信息学的迅猛发展为生物分析方法的不断拓展奠定了坚实的基础,对相关物质的分析不再满足于“是什么物质”和“含量有多少”这两个简单的问题,这就对分析技术的精度提出了更高的要求。生物传感分析方法具有灵敏度高、特异性强等优点,且分析前对样品只需简单处理,操作简单易行,响应迅速,检测时间短,检测结果可靠且可信。1.1 生物传感方法的检测原理生物传感分析方法的工作依赖于待测物质与其识别物质的结
17、合,因此我们在设计一种生物传感分析方法的时候,最重要的工作就是设计一种合适的对应于待测物质的分子识别适体,组织、酶、抗体、细胞、核酸等,都是生物体生命活动中进行特异性的选择辨别的物质基础。这些物质通过与待测目标物质发生特异性识别过程相结合,进而两者形成一种复合物,例如基质与酶的结合、适体与目标分子的结合、生物抗原和抗体的结合等。信号转换装置的选择也是研发高精确度、高灵敏度的优质生物传感器的关键环节,通常我们依据敏感元件所引发的化学变化或者物理变化来选择生物传感体系的信号转换部分。敏感元件化学反应过程中相关物质的生成及消耗、光以及热都会随着反应的进行产生一系列的变化,依据这些变化,我们可以去选择
18、合适的适宜于实验体系的信号转换装置。由于生物的化学反应非常复杂,因此其所产生的生物化学信号也是多种多样且极难追踪检测,现代生物传感技术的研究变得尤为重要,近些年其研究成果为检测生物化学信息提供了极为丰富的手段。1.2生物传感方法的分类目前,已经研究出很多种生物传感分析方法,根据分类标准不同,可以分成不同的类别:例如根据功能分子材料的的不同分类有:DNA生物传感分析方法、酶生物传感方法、微生物传感方法、活体组织传感方法、细胞生物传感方法、免疫传感方法等。 1.2.1 酶生物传感方法酶传感方法是最早发展和研究的一类生物传感分析方法,因此酶传感分析技术也相对比较成熟1-6。它的工作原理是通过酶的催化
19、作用,结合换能装置记录生物分子发生化学反应引起的变化,进而得到待测物质的实际浓度等信息。目前所研制的生物葡萄糖传感分析方法已经用到临床分析中。它的工作原理是将生物酶电极插到待测溶液中,溶液中所含的葡萄糖会扩散到酶电极的表面上,进而葡萄糖发生化学反应,在葡萄糖氧化酶的作用下被氧化生成葡萄糖酸,同时反应消耗了一定量的氧气,最后通过氧电极来测定溶液中所含氧气浓度的变化,从而计算出样品中所含葡萄糖的浓度。1.2.2免疫传感分析方法免疫传感分析方法的基本工作原理:免疫传感分析方法是利用抗原与抗体的特异性结合效应,先使酶与待测样品相连接,之后酶与反应底物发生化学反应,进而达到定量测定目标物质的目的。免疫传
20、感分析方法在生物免疫研究领域有着广泛的应用7-11。使用免疫传感方法这种测定技术大体主要需要三种试剂:酶作用底物、标记物(酶标记抗原或者抗体)、免疫吸附剂(固相抗原或者抗体)。免疫传感分析方法主要有三种构成方法:双抗体夹心法、间接法、竞争法。1.2.3 细胞传感方法细胞传感方法因以动植物活细胞为探测单元,故由此得名。细胞传感方法敏感性高,故其应用范围很广12-15,特别是在癌症的早期诊断上:利用三乙酸纤维素膜把人类脐静脉内皮细胞固定于离子选择性电极上,可以达到一个很好的肿瘤细胞传感检测器的作用。此时,肿瘤细胞所释放的VEGF会刺激细胞,同时,离子选择性电极的电位也会随之发生相应的变化,由此可以
21、用来诊断早期癌症。1.2.4 DNA生物传感分析方法 DNA生物传感分析方法是以DNA为分子识别元件的生物传感方法,由于其依据DNA分子之间的相互作用或者DNA分子与其他相应物质的反应,因此对于分子水平的检测具有超灵敏的效应。将检测探针设计为与被测目标分子特异性识别或者与目标DNA分子对应碱基互补的单链DNA分子,即可实现对探针与目标物之间反应的跟踪分析,最终可完成对目标物的分析检测。DNA生物传感分析方法检测快速便捷、灵敏度高、稳定性强、可重复操作,逐渐成为当今生物分析检测领域的研究热点。2 DNA生物传感方法简介2.1 DNA简介由大量核苷酸聚合而成的生物大分子化合物叫做核酸,核酸是生物体
22、正常生命活动的基本物质之一,其在生物体内,常被用做携带遗传信息,核酸广泛存在于动物细胞、植物细胞以及微生物细胞体内。根据核苷酸排列顺序的不同,可以分为不同的核酸。而根据其化学组成的不同,核酸又分为脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, 简称DNA)与核糖核酸(Ribonucleic acid,简称 RNA)和。DNA在遗传信息的贮存、传递以及复制过程中起着重要的作用,是生物代代遗传的主要物质基础。而RNA也具有传递遗传信息的作用,其主要通过自发组装或者在生物体内自复制来表达或传递遗传信息,除此之外,RNA还在蛋白质的合成过程中起着至关重要的作用。2.2 DNA组成和结构 D
23、NA是一种长链聚合物,它的相对分子质量非常大,大体在几十万甚至几百万,而构成DNA的基本单元主要有三种,分别为脱氧核糖、核苷酸碱基和磷酸。DNA的长链骨架由脱氧核糖(即五碳糖)与磷酸分子之间以酯键相连构成,排列在外侧,而构成DNA的四种碱基则排列在内侧。碱基与五碳糖分子一一相连,根据遗传密码可指导合成蛋白质。 核苷酸碱基分为四种,两种嘌呤分别是鸟嘌呤(guanine G)和腺嘌呤(adenine A),两种嘧啶分别是胞嘧啶(cytosine C)和胸腺嘧啶(thymine T)。生物之所以能够分成不同物种,归根结底是因为DNA的碱基组成有所不同,但是总体仍然遵循一定的规则,即腺嘌呤总数必等于其
24、胸腺嘧啶总数(A=T),而鸟嘌呤总数也必然等于胞嘧啶总数(G=C),因而嘌呤总数之和必等于嘧啶总数之和。DNA从结构方面来讲,一般可以划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。DNA分子的一级结构是指DNA分子结构中核苷酸的排列顺序,即核苷酸之间通过3,5-磷酸二酯键连接且没有支链的环状的或者直线形结构;二级结构则是指是指由两条脱氧核苷酸链以反向平行扭曲盘绕得形式最终而形成的双螺旋结构;DNA的三级结构是指DNA在二级结构的基础之上进一步扭曲盘绕所形成的特定的空间结构,也称之为超螺旋结构;DNA的四级结构则是指核酸以反式作用存在(例如核糖体、剪接体)。 DNA分子结构中,由于碱基之
25、间的氢键具有固定的数目,并且DNA两条链之间的距离也保持固定不变,因此碱基配对需遵循一定的规律,不同碱基之间的这种一一对应的规律叫做碱基互补配对原则,即Adenine(A,腺嘌呤)一定会与Thymine(T,胸腺嘧啶)配对,Guanine(G,鸟嘌呤)一定会与Cytosine(C,胞嘧啶)配对,反之亦然。 图1-1 DNA分子双螺旋结构模型Fig. 1-1 The structure of DNA double helix构成DNA链的通过碱基间配对连接的长链,称为互补链(complementary chain)。两条互补链呈现出反向平行的螺旋结构,每一螺距长度为3.4 nm,内包括10个碱基
26、对。虽然使碱基间配对连接的氢键作用力非常弱,但是由于互补链之间存在着大量的碱基对,所以在自然生理条件下两条链不会自发地分开。但是,如果将其置于高温下,DNA分子内的氢键将会遭到破坏,于是双螺旋结构解离成两条互补单链。这一过程称为高温变性(denaturation)。如果将变性后的两条互补链再置于正常温度条件下,他们又会重新自发连接形成双螺旋结构。这一过程又称作复性(renaturation)。由于A-T之间存在两个氢键,而G-C之间存在三个氢键,所以就变性和复性而言,G-C所需能量比A-T高。大部分DNA自然状态下以双螺旋结构存在,但一经热处理或碱处理就会变性为单链状态。2.3 DNA酶简介根
27、据其功能的不同,可将DNA酶分为不同类别:DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA限制性内切酶、DNA修饰酶、DNA解旋酶等。随着人类基因组计划的启动,各种不同类别的DNA酶也得到了广泛的应用和研究。在DNA片段分析、重组DNA技术、基因诊断、现代医学临床实验中,DNA酶起到了非常重要的作用。在DNA复制过程中,以一条单链DNA为模板,在DNA聚合酶的作用下,将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链,形成链与母链构成一个DNA分子。限制性核酸内切酶主要存在于微生物如细菌、霉菌等中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且能在特定的切点上切割DNA分子。其最早发现于原核生物体内
28、,现已分离出100多种,几乎所有的原核生物都含有这种酶。2.4 核酸适体简介近些年来经科学研究发现,DNA和RNA除了起到遗传信息传递与存储的作用外,还有许多其他的非常重要的作用,例如经过SELEX体外筛选技术(指数富集配体系统进化)而筛选出的寡聚核苷酸片段,具有能特异结合细胞、蛋白质大分子或其他小分子物质的功能,这就是核酸适体。核酸适体能够借助自身所形成的特异性的空间结构与其它类型的靶分子相互作用,而利用寡核苷酸间的严格的识别能力与高度的亲和力成功制备了人工合成寡核苷酸适体(aptamer),这种人工合成核酸适体的出现,使抗体抗原特异性反应发生了新的革命性的变化,弥补了现有自然存在抗体的不足
29、,也为生物传感器的长远发展开辟了一条崭新的道路。核酸适体(aptamer)是由大约25-80个碱基组成的寡聚核苷酸片段,能与蛋白质、细胞、生物活性小分子等靶物质特异性结合,对靶物质具有高度的亲和性与特异性的识别能力,既可以是DNA单链也可以是RNA单链16,17。而结合核酸适体所提出的生物传感分析方法则是利用核酸适体与靶物质之间的特异性识别能力进行相关靶物质的检测的生化分析方法。核酸适体是一种作用类似于抗体的核酸单链分子。通过SELEX技术(即指数富集配体系统进化技术)可以从人工构建的随机单链寡核苷酸文库里筛选出来具有一定功能的核酸适体。首先可以利用SELEX技术从核酸文库中筛选得到寡核苷酸片
30、段,再将寡核苷酸片段进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)进行扩增,最后将其排列成一个特定的识别单元18-20。1990 年,Tuerk课题组21首先利用SELEX 筛选技术得到了特异性识别噬菌体T4 DNA聚合酶的RNA适体,自此之后这项筛选技术就成为了各国科研学者的研究热点,进而为化学、生物以及医学领域的研究不断提供大量的特异性核酸适体,增加了检测手段,提高了待检物质的范围,同时也大大提高了检测限和检测效率。利用SELEX 技术从库容量为1015 左右的随机的寡核苷酸序列库中筛选到与待测靶分子能够特异性识别的一系列核苷酸序列,然后继续将这一序列通过
31、数轮的筛选、分离与扩增,最终得到与靶物质结合能力最强的DNA单链或RNA单链。核酸适体主要具有以下几个方面的特点:(1)严格的识别能力与高度的亲和力:寡聚单链DNA或者RNA可以形成多种具有热力学稳定性的三维空间结构,因此它与靶分子有高度的亲和力。相比于其它种类的配体,核酸适体对目标物质的亲和力解离常数约在10-12 M 10-9 M范围之间22,23,并且有些适体的结合能力甚至超出了其天然配体。例如角质细胞生长因子与其对应的核酸适体结合的解离常数竟高达300 fM,是迄今为止发现的亲和力最高的适配体对24。(2)目标物质范围广:适体所结合的靶分子不仅仅限于蛋白质和核酸,还同样适用于生长因子、
32、酶、基因调节因子、植物凝集素、抗体、完整的病毒颗粒以及病原菌等。同时适体也可以用作小分子量目标分子的检测,包括辅因子、药物、金属离子、氨基酸、氨基糖苷、以及抗生素等。(3)人工合成、便于修饰。经过筛选后的核酸片段可以通过人工合成路径得到,不依赖于细胞或者动物,所需费用低。可根据其用途在特定的位置修饰上标记物或者官能团且不影响核酸适体本来的生物活性,例如生物素标记、荧光标记、酶标记、放射性标记,从而实现核酸适体分子由单功能向多功能的转化。(4)用于诊断性实验的广泛性:适体与靶分子之间的的特异性结合类似于抗原抗体特异性识别所形成的复合物,其结合信号能通过多种方式表现出来,因此可以应用分子信标、流式细胞技术、荧光偏振、传感器以及毛细管电泳等多种检测手段,其应用的普遍性远远超过抗体。(5)稳定性好:核酸适体具有良好的稳定性,可以反复变性、复性而不损伤其生物活性。因此将核酸适体冻成干粉后可以保存数年,取出后适当溶解又可以立刻恢复其生物功能,因此核酸适体与抗体相比具有很多优势。近几年来,核酸适体生物传感器的研究得到了迅猛的发展,在新型核酸适体传感器的设计方面、其分析特征例如灵敏度、稳定性以及线性
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