裂解液作用.docx

1、裂解液作用1、核酸抽提原理之迟辟智美创作简单地讲，核酸抽提包括样品的裂解和纯化两年夜步伐.裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成份，如卵白质、盐及其它杂质完全分离的过程.经典的裂解液几乎都含有去污剂 （如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等） 和盐 （如 Tris、EDTA、NaCl 等）.盐的作用，除提供一个合适的裂解环境 （如 Tris），还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 （如 EDTA）、维持核酸结构的稳定 （如 NaCl） 等.去污剂则是通过使卵白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的卵白质，从而实

2、现核酸游离在裂解体系中.裂解体系中还可能加入卵白酶；利用卵白酶将卵白质消化成小的片段，增进核酸与卵白质的分开，同时，也便于后面的纯化把持以及获得更纯的核酸.也有直接使用高浓度的卵白质变性剂 （如 GIT、GuHCl 等） 裂解的，该方法已经成了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流.最经常使用的纯化方法，一是 PC 抽提 + 醇沉淀，二是介质纯化.第一种方法是利用 PC 对裂解体系进行反复抽提以去除卵白质，实现核酸与卵白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离.第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附卵白质及盐的特点，实现核酸与卵

3、白质及盐的分离.高盐沉淀去除卵白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了 PC 把持的麻烦.固然，也有不纯化的抽提方法，可是用途多局限于简单的 PCR.其它杂质 如多糖、多酚等 - 的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特另外试剂，或者增加一些额外的步伐来实现的.2、了解你的实验样品如果你研究某个实验样品，而且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量.如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂时，抽提核酸的实验就会碰到许多问题.以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组 DN

4、A，怎么可能胜利？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了解，才华正确选择裂解方法.绝年夜部份情况下，使用新鲜样品可以获得最好的结果.对一些杂质含量高的样品，如果使用新鲜样品抽提基因组 DNA 是碰到杂质残留过年夜的问题，可以试一下 -20C 保管一天后再抽提的对策，可能会有意想不到的效果.样品如果因为某些原因必需先行保管，也要先简化一下样品：血液最好只保管有核细胞；将样品分割后保管，防止反复冻融.如果实验室不具备合适的保管条件，将样品先裂解后再保管，是一个不错的选择.3、裂解方法的评价含卵白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选.裂解包括膜卵白的游离和与基因组 DNA

5、 相连接的卵白质的游离.卵白酶的作用是使卵白质变小，故而对卵白质的游离有巨年夜的增进作用；同时，巨年夜的基因组 DNA 是很容易“缠”住年夜分子的工具的，卵白质被卵白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA “缠”住，有利于卵白质在纯化把持中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高.另外一个思路是，如果基因组 DNA 与卵白质 “缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA 的特性占优势，则纯化时以 DNA 的形式被保管下来，招致卵白质的残留；如果卵白质的特性占优势，则纯化时以卵白质的形式被去除，招致 DNA 的损失.有些样品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也强烈建议使用含卵白

6、酶的裂解液 （或者在把持中的某个时候使用卵白酶消化卵白质） ，原因在于这些样品中的卵白质，是非常难以去除的.该方法是获得最年夜得率和最高纯度的基础.不使用卵白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及把持简单很重要时.控制好裂解液/样品的比例是该方法胜利的关键.该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的把持，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些.高浓度卵白质变性剂 （如 GIT、GuHCl 等） 的裂解方法，是抽提 RNA 的首选.总 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的卵白质的裂解以及基

7、因组与卵白质 “缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化发生年夜的影响，可以不考虑.高浓度卵白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶，从而确保了 RNA 的完整性.除极少量不适用该方法的样品 主要是植物，其它绝年夜部份样品的 RNA 的抽提，都可以以高浓度的卵白质变性剂为基础的.该方法也可用于基因组 DNA 抽提，非常快速简单，但纯度不是很高.含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法.该方法胜利与否与两个因素有关：一是 CTAB 的质量，二是洗涤的完全水平.CTAB 的质量对裂解效率有很年夜的影响，而且，似乎还说不清楚原

8、因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的 CTAB，批号分歧，效果就可能分歧很年夜.洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时， CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨年夜影响，所以洗涤是否完全也是该方法胜利与否的关键.裂解时的温度，多使用 65C；但如果发现降解严重或者得率太低，可以试一下 37C 45C 这个相对高温的区域.SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点.控制好裂解液/菌体的比例和把持的温和是该方法胜利的关键.卵白质的沉淀效率在 4会更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4静置一段时间以及采纳 4C 离心去卵白质，都可以提高质量

9、.该方法纷歧定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒.RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A （100ug/ml） 或者在最后的溶解液中加入 RNase A （25 ug/ml） 来实现.总的感觉是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的残留少一些.不外，经典沉淀几乎没有法子完全去除 RNA 残留.另外，对年夜质粒 （50 kb 以上），该方法可能会有问题.PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法.该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速.也正因为不纯化，所以，假阴性 （即没有扩增出来的阳性） 比例也

10、比力高.该方法最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应，而且能提高裂解效率，甚至还可能部份消除样品内抑制 PCR 反应杂质的工具，如 Triton X-100、甲酰胺等.再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部份杂质的介质.把持也非常简单，多使用温度的变动来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-高温的屡次循环等.该方法最适合从一年夜堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性.降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的抑制物量的降低.选择了合适的裂解液，下一步就是要控制好样品与裂解液的比例.这个问

11、题非常重要，但却没有获得足够的重视.严肃的参考资料，都应该会提供一个简单的比例，如 1ml 裂解液可以用于 T mg 组织或者 C 个细胞；我的建议是，你的样品量绝对要小于资料所提供的.起始样品用多年夜，并没有具体的说法.如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次胜利实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的基础，会比力合理的.不要因为 1ml 裂解液可以抽提 100mg 样品，就一定使用 100mg 样品.裂解液的用量，概况上与抽提的结果 （纯度及得率） 没有关系，然而，在实际把持中，对结果是有比力年夜的影响的.裂解液的用量原则是：确保能完全裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中.浓渡过低，将招

12、致沉淀效率低，影响得率；浓渡过高，去除杂质的过程复杂且不完全，招致纯度下降.另外，裂解液的用量是以样品中卵白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记.4、纯化方法评价PC 抽提/醇沉淀方法，是一个永不外时的方法.稳定、可靠、经济、方便.PC 抽提可以完全去除卵白质，醇沉淀可以去除盐，对一般的干净的样品 （杂质为卵白质），该方法完全可以获得高质量的核酸.虽然每次 PC 抽提城市损失一部份核酸 （因为不成能将水相全部移取），以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都可以靠把持的调整而得以解决或者减少影响.该方法的最年夜的问题是不适合年夜规模抽提.PC 抽提是去除卵白质的一个非常有效

13、的手段.苯酚能使卵白质变性，变性后的卵白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间.PC 抽提的关键是，一要混匀完全，二要用量足够.完全混匀，才华确保苯酚与卵白质的充沛接触，使卵白质完全变性.许多人总是担忧混匀的剧烈水平是否会对核酸，尤其是基因组 DNA 造成破坏，实际上年夜可不用如此小心.剧烈的混匀把持，是会部份打断年夜分子的基因组 DNA，但该破坏作用不会强烈到 DNA 酿成 10kb 以内的小片段.手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，年夜部份会年夜于 20kb，这个年夜小，除一些特另外要求外，对 PCR 和酶切，都是完全适用的.如果要求的片段非常年夜，如构建文库用，则不能使用剧

14、烈的混匀方法，而只能来回温和倒置混匀 此时的关键是：裂解液的比例要足够年夜，使体系不要太粘稠.用量要足够，是因为苯酚去除卵白质是有一定的饱和度的.超越了该饱和度，裂解体系中的卵白质不会被一次去除，必需靠屡次抽提，方可完全去除.另外，体系太粘稠的坏处是，卵白质难以完全去除，以及基因组 DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例.4C 离心把持有利于更完全去除卵白质.PC 抽提的另外一个用途是，利用酸性酚可以部份去除 DNA 的特点，在 RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA.不外有一点要提醒的是，有些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能使用 PC 抽提的，否则核酸肯定降解.高盐

15、沉淀卵白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法.与 PC 抽提方法相比，除纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点.更快、更轻松去除卵白质所陪伴的好处是，可以用于年夜规模抽提，缺乏是纯度 （卵白质残留） 不够稳定.卵白质的沉淀效率在 4C 会更好一些.介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法.其最年夜特点是非常适合年夜规模核酸抽提，而且因为受人为把持因素影响小，纯度的稳定性很高 （虽然纯度纷歧定比PC 纯化方法更高）.其致命弱点是样品过量.介质可以分为两年夜类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状 （如Glassmilk、磁性小珠等

16、）.颗粒状的介质的纯化把持与经典的醇沉淀分歧不年夜，都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好的核酸.柱式纯化的把持虽然也是有加液-倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更完全，把持更省力 （不用费心将核酸倒失落了，或者液体的残留）.不外，介质纯化方法的本钱是最高的.5、醇的沉淀醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质 主要是盐 的分离.实际把持中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比力高的时候.醇的沉淀其实不是非常特异性的，任何有机年夜分子及一些盐，当浓度到达一定水平

17、后，都可能同步被沉淀下来.就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说这些盐是必不成少的或者醇的比例是不成更改的.实际把持中不难发现，当裂解体系中核酸的浓度到达一定水平后，即使体系中不含教科书中建议的盐，独自使用醇也可以使核酸沉淀下来；或者含有盐，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来 （固然，得率可能会降低）.知道这一点的意义在于：不要迷信标准方法的唯一性；相反，当使用标准方法碰到问题 主要是纯度问题 时，完全可以通过调整沉淀条件来改善.最有参考价值的是 TRIzol 提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯洁的异丙醇，可以年夜年夜降低多糖残留.另外一个问题就

18、是，要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然会降低核酸的得率，但因为可以年夜年夜提高纯度.如果核酸抽提的起始样品是比力“脏”的，原则上不要使用高温沉淀.高温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比力高时，效果不明显，但却会招致杂质的年夜年夜增加.醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我没有发现这二者对证量有年夜的影响，虽然许多人“发现”乙醇沉淀的核酸纯度更高.异丙醇沉淀的核酸比力紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比力蓬松，容易从壁上移动，颜色比力白.这是现象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸不容易丧失落，但比力难洗涤.结合丧失和洗涤两个方面综合考虑，则

19、建议：少量核酸用异丙醇沉淀 （量少，洗涤不是问题，不丧失为先），年夜量核酸用乙醇沉淀 （量年夜，丧失不是问题，洗涤方便为先）.至于异丙醇沉淀更容易沉淀下盐的说法，我没有碰到过 （我几乎不使用高温沉淀，难道高温沉淀比力容易呈现盐沉淀？）；我更觉得呈现该现象的原因就在洗涤的不完全.固然，也不要忘记异丙醇沉淀的最年夜优点是体积小，可以使绝年夜部份的小量抽提把持在 1.5ml 离心管内完成.但由于其沉淀物很紧凑，洗涤时其中心部份不容易被洗涤到，所以，洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是：一定要使沉淀悬浮起来，一定要放置一段时间使沉淀最终酿成蓬松的白色.如果再洗涤一次，质量决不会有问题的.PEG、LiCl、CT

20、AB 都可以用于核酸沉淀.虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点.LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来.PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段.6、洗涤洗涤首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要有一定的时间，尤其是当核酸沉淀比力年夜时 （使核酸沉淀最终蓬松）；第三是少量屡次；第四则是去上清要完全.教科书中的把持基本上都是“倒失落上清后倒置在吸水纸上片刻”，这一描述自己没有问题，且十分方便，但因为他来自国外，自然就有了“水土不服”的问题.如果离心管是经过硅化的，因为液体几乎不挂壁，所以上清可以去除得非常完全；好的管子，即使没有经过硅化，残留

21、量也非常少，也没有什么问题；差的管子，液体的挂壁非常可观，其残留量多到会影响后续的实验.唯一不受管子质量影响的把持，就是倒失落液体后再长久离心，将残液用移液器吸出.一定要牢记的是，残液中都含有上一步把持中的杂质，其残留量与混匀水平、核酸沉淀的年夜小都有关.挥发时去失落的是乙醇，杂质是不会被挥发去除的.另外，核酸沉淀的年夜小及裂解液的裂解能力也决定了洗涤的强度.沉淀越年夜，裂解液的裂解能力越强，洗涤越要完全：放置时间相对要长一点，洗涤次数也要考虑增加.最关键的，洗涤一定要用室温的 75% 乙醇.7、核酸的溶解和保管纯化后的核酸，最后多使用水或者低浓度缓冲液溶解；其中 RNA 以水为主，DNA 则

22、多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解.经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险；如果把持过程控制适当，DNase 的残留几乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 （pH 接近 7） 溶解 DNA.基本上，核酸在保管中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比.虽然也有部份实验人员发现，-20C 保管的 DNA 比 -70C 保管的稳定，我却宁可认为这是个例.如果温度合适，保管中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留招致的酶解，第二个原因则是保管核酸溶液的 pH 值分歧适招致的水解 （RNA 在弱酸性更稳

23、定，而 DNA 在弱碱性更合适）.还有一个不为人重视的，就是 EP 管对核酸的影响.首先一定要坚信一点，那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应，到达某种均衡.EP 管的材质，首先可能吸附核酸，其次还可以诱导核酸的结构发生某些变动，如变性.在核酸的浓度比力高时，这个现象可能观察不到；当核酸浓度很低时，则比力明显了.在低浓度的核酸中加入 Geletin，Glycogen，BSA 可以稳定核酸，虽然已经为实验所证明，但许多实验人员并没有将该建议当回事.现在制造 EP 管的资料远多于过去.这些新呈现的资料，在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯 PP 材质要好许多，但其化学特征，尤其是对核酸

24、稳定性的可能影响，远没有研究透彻.正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样，其负面产物可能是，抽提的质粒电泳的构型越来越多：除原来的三种带型外，还可能呈现 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型.8、核酸质量的检测问题将抽提好的核酸直接用于后续的实验，是唯一可靠的检测方法；除此之外的检测方法，都是相对的，而且其实不十分可信.目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光光度仪.电泳检测的主要是核酸的完整性和年夜小，只要核酸不是太小或者太年夜 （超越电泳分离范围），该方法还是非常可信的；电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验

25、有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息，可是同样与经验有关.紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度仪不能确保非常准确，而该仪器的灵敏度又非常高，所以，提供的结果其实不十分可信.一般讲，同时进行紫外和电泳检测，综合二者的结果，可以做出一个更合理的判断.但由于这两个方法都有缺陷，所以，即使呈现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不用年夜惊小怪.关于紫外分光光度仪的检测.首先，不要使用不能选择波长的仪器；使用那些已经固定了波长的仪器，年夜概可以算是你梦魇的开始.（没有信息是可怕的，更可怕的是将毛病的信息认真.） 其次，一定要经常调较仪器；调较可以使用非常

26、纯的自备核酸，也可以使用苯酚 （后者是我目前每次都使用的方法，非常简单；具体事理可以见我以前的帖.） 最后，要记住读数 A230 ： A260 ： A280 = 1 ： 2 （DNA 为 1.8） ： 1 为理论上的数据，实际测按时会有一些分歧；但如果分歧太年夜，就有问题了.有两个值得商榷的观点：如果 A260/A230 2 就是纯的，如果 A260/A280 2.3 就是核酸降解.A260/A230 如果比 2.0 年夜许多，一定是有杂质残留的 （具体是什么杂质我不知道）.如果核酸抽提好后立即就测定，A260/A280 2.3 决不提示核酸降解，原因是：那些能招致 A260/A280 2.3

27、 的核酸片段非常小，惯例的沉淀是不成能将它们沉淀下来的；更可能的原因是：你仪器提供的 A260/A280 实际是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值.纯的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰顶，在 A280 则正好是半山坡.根据曲线在底和顶的斜率最小，在半山坡的斜率最年夜的特点，不难得出如下结论：A230 和 A260 的读数受仪器准确性的影响比力小，而 A280 受仪器准确性的影响比力年夜.建议先电泳检测，再用紫外分光光度仪检测.电泳后，可以看到哪些样品根本就不能用 （如降解太厉害），以及核酸的年夜致浓度，这样就为紫外分光光度仪的检测提供了一个参考 （降解的

28、不需要测了，要测的该取几多量等）.9、问题解答非常基础的问题就不再罗嗦，目的是想对一些选项众多的问题解答进行简化：如果某一因素占了 70% 以上的可能性，我就只提该因素了.还有一些解答与部份人的知识可能相抵触，也请不要放在心上，因为它们也与我昔时从书本上学习的知识相抵触.我记性差，什么都是看完就忘；但这也有好处，做实验历来没有框框.看一看，想一想，做一做 管用就好.A 抽提过程中的现象及可能的原因I：核酸不溶解或者难溶解 卵白质残留 （虽然目前更多的资料强调的是过分干燥所致.）.75% 乙醇洗涤后，如果是空气干燥，几乎不成能过分干燥的，尤其是在南方湿润的处所.佐证实验：撕取少量 Merck 的

29、丝状CT DNA 到一个离心管中，加入无水乙醇；10 分钟后完全去除乙醇；待乙醇完全挥发后，加入 TE，10 分钟后溶液就非常均匀而粘稠了.II：使用异丙醇沉淀核酸，沉淀为白色 多糖残留.III：核酸溶解后为乳白色 多糖残留.IV：75% 乙醇洗涤异丙醇沉淀的核酸时，沉淀变年夜了 见 10-III.B 紫外检测I：A260/A280 比值低 卵白质残留.但如果把持过程中使用了苯酚，则更可能是苯酚残留.II：A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差 苯酚残留.C 电泳中的现象及可能的原因I：加样孔有荧光 首先一定有 DNA 的滞留；其次多含卵白质残留；如果是比力特殊的样品，其杂质

30、也可能招致荧光.卵白质几乎不会被 EB 染色，能呈现荧光，则一定含有核酸.非常巨年夜的基因组DNA （ 50kb），如果使用普通的琼脂糖电泳，往往不能电泳出孔，独自就可能滞留在加样孔中发生荧光.更多的时候，是比力年夜的 DNA 与残留的卵白质结合后，电泳不能出孔而在孔中发生荧光.酶反应产物，如果没有经过纯化去除酶，也非常容易在孔中呈现荧光，其原因是酶与核酸几乎都有比力强的结合能力 （基因组 DNA 的PCR 产物电泳往往在孔中都有荧光，而且荧光强度与体系的特异性成反比.）.如果是植物样品，还可能由其它杂质残留引起.我的经验是：卵白残留的荧光有点发闷，其它杂质残留亮得很刺目，且薄得锐利.II：总

31、 RNA 非变性电泳显示过多的条带 根本就不是问题.III：总 RNA 非变性电泳显示 28S 不如 18S 亮，但条带清晰无弥散 多提示 28S 没有被 EB 饱和.RNA 残留多时，基因组 DNA 的电泳也会有相似现象.简单的补染可以解决此问题.再次电泳时，或者降低上样量，或者增加胶中 EB 的量.D 降解的现象、原因及对策降解的现象，如果抛开问题电泳所致，可以简单总结如下：主带不再突出，向小片段方向发生弥散，亮度比力均衡地衰减.如果同时还陪伴下列的一个或者多个现象，则需要更进一步的检测：加样孔非常的亮、弥散发生在主条带位置的上下两个方向、从加样孔即开始发生弥散.以现在的裂解液的裂解能力而

32、言，降解的发生主要是在完全匀浆之前，只有极少量由不干净的溶解液招致.以总 RNA 抽提为例，本站就有帖总结为：总 RNA 的质量由高到低依次为悬浮细胞、贴壁细胞、组织 （此处的质量不单指纯度，也指完整性才对）.完全裂解悬浮细胞的时间最短，完全裂解组织的时间最长，这就是降解多发生在完全匀浆之前的一个佐证.再看一看新鲜样品和冷冻保管样品，非常严格的冷冻保管和匀浆把持简直可以确保冷冻样品的核酸的质量；可是，有许多实验室其实不具备严格的保管手段，实验人员的把持也其实不是完美，其结果就是核酸的降解.RNA 抽提受的影响因素太多，就以基因组 DNA 的抽提为例看一看吧.假定消化使用的是含卵白酶 K 的溶液，无论你使用的是新鲜样品还是冷冻保管样品，如果混匀完全，可以预期的降解为：细胞 不应该降解，碾碎的组织 不应该降解，年夜块组织 （包括鼠尾） 部份降解.如果电泳发现新鲜的细胞和碾碎的新鲜组织发生了降解现象，该现象是假象；如果电泳发现冷冻的细胞和碾碎的冷冻组织发生了降解现象，该现象不是假象，就是样品在保管中已经降解了.说得更极端一点，即使卵白酶 K 失活了，消化试剂的裂解能力也足以保证细胞的基因组 DNA 在抽提过程中间不被降解.减少或者根绝核酸降解，一定要将重点