有机类饮用水毒副产物毒理学研究方法进展.docx

1、有机类饮用水毒副产物毒理学研究方法进展有机类饮用水消毒副产物毒理学研究方法进展杨帆，楚文海，张永吉，尹大强 同济大学环境科学与工程学院，长江水环境教育部重点实验室，上海 200092摘要：基于国内外对有机类饮用水消毒副产物(DBPs)毒理学效应的研究成果，以及消毒技术的发展过程，系统划分了有机类DBPs的种类：含碳消毒副产物(C-DBPs)和含氮消毒副产物(N-DBPs)。并对一些典型DBPs的毒理学研究方法进行了归类总结，分析了相关研究的发展趋势和不足，并且对今后的研究方向提供了相关建议。关键词：饮用水；消毒副产物；毒理学Research Advance of Toxicology Rese

2、arch Methods about Organic Disinfection By-products (DBPs) in Drinking WaterYang Fan, Chu Wenhai, Zhang Yongji, Yin Daqiang College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, Shanghai 200092, ChinaAbstract: N

3、itrogenous disinfection by-products (N-DBPs) have increasingly become a public health concern in the drinking water industry because they have been found to be more geno- and cytotoxic than most of the currently regulated carbonaceous DBPs (C-DBPs). In this study, the type of DBPs, including N-DBPs

4、and C-DBPs, was introduced. Also, the toxicological research method for these DBPs was summarized. Moreover, the development trend and current shortage of this method were analyzed, and the corresponding recommendation and countermeasure proposed, which was hoped to be helpful in the research of DBP

5、s toxicology.Key words: drinking water; disinfection by-products (DBPs); toxicology1 引言对饮用水消毒副产物(disinfection by-products, DBPs)的研究始于1974年，研究发现用氯作为消毒剂时，将会产生许多DBPs，研究较集中于三种含碳DBPs(C-DBPs)，即挥发性三卤甲烷(Trihalomethanes, THMs)，难挥发性卤乙酸(Haloacetic acids, HAAs)1以及其它一些C-DBPs如卤化醛酮等，其中以卤代呋喃酮(mutagen X, MX)最为典型2。同时

6、，毒理学家对于这些DBPs的毒性作用展开研究，结果表明THMs和HAAs在一定程度上都具有致畸、致癌和致突变的“三致”作用3，MX也有较强的致诱变性4。近年来，随着替代消毒剂的单独或联合使用，以及相关研究的不断深入，在饮用水中又发现了越来越多的新兴DBPs，这些化合物以含氮消毒副产物(nitrogenous disinfection by-products, N-DBPs)为主。如：卤化硝基甲烷(Halonitromethanes, HNMs)5，卤化乙腈(Haloacetonitriles, HANs)6，卤化乙酰胺(Haloacetamides, HAcAms)7，N-亚硝胺类物质(N-n

7、itrosamines, NMs) 8，卤化氰(Cyanogen halides, CNXs)9等。随着饮用水消毒副产物种类的多样化，其生物毒性和健康风险也越来越受到人们的关注。国内目前对DBPs生物毒性的研究起步较晚，并且在研究方法和内容上都有一定的局限性，而只有在明确DBPs的毒理学特征后，才能使学者在今后的相关研究中分清主次。本文根据国内外的相关研究，对DBPs进行了归纳分类，讨论分析了几种典型DBPs的毒性研究所采用的毒理学研究方法，为进一步进行DBPs的毒理学特性研究提供借鉴和依据。2 饮用水消毒副产物液氯用于饮用水消毒已有百余年的历史，目前，我国采用氯消毒剂的水厂占99.5 %以上

8、10，美国等发达国家的氯消毒剂利用率也多在90%以上11。在消毒过程中，氯消毒剂在水体中与有机物或无机物发生取代、加成等一系列化学反应产生相应的DBPs，较典型的有THMs，HAAs和MX。由于这些DBPs会产生一定的健康风险，各国对于饮用水DBPs中相关物质的含量限制越来越严格，使得许多饮用水单位不得不更换新的消毒技术。现在所选用的饮用水消毒方式主要有二氧化氯消毒、氯胺消毒和臭氧消毒，同时也加强了物理消毒技术和组合消毒技术的应用。随着新兴消毒技术的运用以及现代分析技术的不断发展，在饮用水中检测出多种含氮消毒副产物(N-DBPs)2,8。表1对这些DBPs进行了归纳小结。表 1 DBPs的分类

9、Table 1 Classification of DBPs分类代表物质英文缩写结构式C-DBPs三卤甲烷(Trihalomethanes, THMs)1,8,12,13三氯甲烷TCM溴二氯甲烷BDCM二溴氯甲烷DBCM三溴甲烷TBM二氯碘甲烷DCIM溴氯碘甲烷BCIM卤乙酸 (Haloacetic acids, HAAs)1,8,12一氯乙酸CAA二氯乙酸DCAA三氯乙酸TCAA溴氯乙酸BCAA溴二氯乙酸BDCAA二溴氯乙酸DBCAA溴乙酸BAA二溴乙酸DBAA三溴乙酸TBAA一碘乙酸IAA溴碘乙酸BIAA致诱变化合物(mutagen X, MX)2及其同系物3-氯-4-(二氯甲基)-5-羟

10、基-2-(5氢)呋喃酮MX(Z)-2-氯-3-(二氯甲基)-4-氧化丁烯酸ZMX(E)-2-氯-3-(二氯甲基)-4-氧化丁烯酸EMXN-DBPs卤化硝基甲烷(Halonitromethanes, HNMs)5, 14一氯硝基甲烷CNM二氯硝基甲烷DCNM三氯硝基甲烷TCNM一溴硝基甲烷BNM二溴硝基甲烷DBNM三溴硝基甲烷TBNM二溴一氯硝基甲烷DBCNM一溴二氯硝基甲烷BDCNM一氯一溴硝基甲烷CBNM卤化乙腈(Haloacetonitriles, HANs)6氯乙腈CAN二氯乙腈DCAN三氯乙腈TCAN溴乙腈BAN二溴乙腈DBAN溴氯乙腈BCAN碘乙腈IAN卤化乙酰胺(Haloaceta

11、mides, HAcAms)7, 15一溴乙酰胺BAcAm二溴乙酰胺DBAcAm氯乙酰胺CAcAm二氯乙酰胺DCAcAm三氯乙酰胺TCAcAmN-亚硝胺(N-nitrosamines, NMs)16N-亚硝基二甲胺NDMAN-亚硝基吡咯烷NPYRN-亚硝基吗啉NMORN-亚硝基吡啶NPIPN-亚硝基二苯胺NDPHAN-亚硝基甲基乙基胺NMEAN-亚硝基二乙基胺NDEAN-亚硝基二丙胺NDPAN-亚硝基二丁胺NDBA卤代氰(Cyanogen halides, CNXs)9氯化氰CNCl溴化氰CNBr3 消毒副产物的毒理学及其方法研究进展由于DBPs的种类越来越多样化，其生物毒性和健康风险也越来越

12、受到人们的关注，许多专家对各类DBPs毒性作用都展开了一定研究，研究方法也各有不同和侧重。本文主要对表1中几类典型（C-DBPs）和新兴（N-DBPs）的DBPs毒理学特征及研究方法进行探讨。3.1 含碳消毒副产物毒理学及其方法研究进展3.1.1 THMs THMs是最早发现的饮用水消毒副产物17，它们对龋齿类动物具有较强的致癌作用，可以作用于肝脏，大肠和肾脏，产生较强的毒性18，并且已被确认为致癌物。在过去三十多年中，已有诸多学者对THMs的毒性以及作用机理展开了较深入的研究。1994年，Melnick等19以大鼠 (rat) 为模式动物，对大鼠进行口暴露实验表明较高剂量的BDCM能使90%

13、的雄鼠诱发腺癌，体外实验表明溴代THMs比氯代THMs对直肠癌的毒性强。1997年，DeMarini等20对BDCM，TBM，DBCM，DCM（二氯甲烷）四种THMs在谷胱甘肽-S-转移酶存在的条件下作用于沙门氏菌(S. typhimurium)所引起的基因突变进行了研究。选取HisG46为突变基因位点，检测突变光谱的变化情况，测得在谷胱甘肽-S-转移酶存在时，G-C转变为A-T的概率为96 % - 100 %，且诱变能力的大小为：TBM CDBM BDCM DCM。类推到人体，BDCM，TBM，DBCM三种物质受谷胱甘肽转移酶的调控，而不同于其他含氯THMs21，所以两类物质对人体的作用机制

14、不同。Lilly等13在1997年测定了TCM和BDCM分浓度注射入雄性F-344大鼠体内，测定毒物对大鼠肾毒性和肝毒性的影响，选用的指标有丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)，天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)，脲氮(urea nitrogen, BUN)，肌酸酐(creatinine, CRE)，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)，总蛋白(total protein, TPR)，血清山梨醇脱氢酶(Serum sorbitol dehydrogenase, SDH)和尿A-乙酰

15、葡萄糖胺酶(urine A-acetylglucosaminidase, NAG)的活性。实验结果表明BDCM在低剂量的作用下对肾脏的急性毒性比TCM要强，并且对肾脏的慢性毒性要比TCM的作用要持久。这与Lilly等12在1994年的研究结果符合。由于碘代三卤甲烷正在成为科学界新兴的研究热点，Richardson等22对DCIM和BCIM的毒性展开了研究，他们选取中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) AS52为受试细胞，来测定DCIM和BCIM的慢性细胞毒性和急性遗传毒性，同时也将结果与一些含碘乙酸和一些新兴的碘代酸类物质的毒性进行综合比对。用测定细胞密度的变化来确定慢性细胞毒性，选取的指标为%C1/

16、2，即细胞密度为负对照的50 %时的DBPs的浓度；用单细胞凝胶电泳(SCGE)测定急性遗传毒性，指标为拖尾率。细胞毒性的大小排序如下：TIM（三碘甲烷） BDIM（溴二碘甲烷） DBIM（二溴碘甲烷） BCIM CDIM（氯二碘甲烷）。3.1.2 HAAs 早期动物生物检测数据表明HAAs不仅对生殖系统有影响，而且还有胚胎毒性和致畸作用，主要表现为多种生殖损害和发育损害23。1997年，Giller等24运用三种方法测定比较了几种HAAs的细胞毒性作用，首先对大肠杆菌 (E.coli) PQ 37进行SOS显色实验，测定-牛乳糖甘酶和碱性磷酸化酶的活性；然后通过对S. typhimurium

17、 TA100菌株进行Ames变异反应突变实验，运用比色法定性；最后对伊比利亚肋突螈 (Pleurodeles waltl) 进行微核实验，由红细胞中微核数的多少来确定这些物质的毒性大小。最后得出结果：BAA CAA DBAA DCAA TCAA TBAA。2002年，Kargalioglu等25用同样的物质对S. typhimurium TA100进行微孔板细胞毒性测试，测定细胞经HAAs暴露210分钟后在595 nm处的光密度，即OD595的值，定量测定这些HAAs的细胞毒性大小，结果为：BAA DBAA CAA TBAA TCAA DCAA。同时对这些物质在经过细胞毒性因素调整之后的遗传毒

18、性比较为：BAA DBAA DCAA CAA，而TBAA和TCAA没有诱变性。2002年，Plewa等26采用CHO AS52为受试细胞，用微孔板实验测定细胞密度在暴露前后的变化以确定慢性细胞毒性，细胞密度为负对照的50 %时的DBPs的浓度%C1/2为测试指标，结果为：BAA DBAA CAA TBAA DCAA TCAA，用SCGE实验确定急性遗传毒性，以拖尾率为指标，结果表明：BAA CAA DBAA TBAA，而DCAA和TCAA几乎没有遗传毒性。2010年，Attene-Ramos等27对人体小肠上皮细胞FH74进行实验，除了测定比较了CAA，BAA，IAA的细胞毒性大小为：IAA

19、BAA CAA；用SCGE测得的遗传毒性大小为：IAA BAA CAA；并且进一步合成cDNA，用实时定量PCR分析其基因表达，具体检测的基因表达功能包括：损伤DNA结合，DNA修复，细胞周期调控和细胞凋亡等。比较相关实验所得结果25-27，发现细胞毒性和遗传毒性之间有一定的相关性28，而对S. typhimurium实验所得的结果与选用CHO为受试细胞所得出的结果无相关性，表明用S. typhimurium为受试细胞所得的数据无法准确预测DBPs对哺乳动物细胞产生的毒性效应。3.2 含氮消毒副产物毒理学及其方法研究进展3.2.1 HNMs 早期研究表明，THMs对于龋齿类动物具有较强的致癌作

20、用，可以作用于肝脏，大肠和肾脏，产生毒性作用18，同时也有胚胎毒性和致畸作用。然而，有研究表明28，与THMs对应的HNMs的诱变性远大于THMs，产生的细胞毒性至少10倍于THMs，所采用的方法是将S. typhimurium TA100菌株与HNMs培育三天之后，测定突变体克隆子的数量。2004年，Kundu29用相同的实验方法对9种HNMs分别作用于S. typhimurium TA98, TA100, TA104, TPT100, RSJ100在非代谢活化(-S9)和代谢活化(S9)两种情况下的诱变能力进行排序，并得出结果。在非代谢活化时，(TBNM CBNM DBNM) (BNM B

21、DCNM) (TCNM DCNM CNM)；在代谢活化时，(DBNM CBNM TBNM) BNM BDCNM) (DCNM CNM TCNM)，而DBCNM未观察到细胞毒性。同年，Plewa14用CHO AS52做实验，采用酶标仪在595nm波长下测定细胞的吸光度值并进行单细胞凝胶电泳实验，检测了9种HNMs的慢性细胞毒性和急性遗传毒性。当CHO暴露于HNMs毒物72小时之后，毒性大小为：DBNM DBCNM BNM TBNM BDCNM CBNM DCNM CNM TCNM，而DNA的遗传损伤为DBNM BDCNM TBNM TCNM BNM DBCNM CBNM DCNM CNM。在此基

22、础上，2009年Liviac30 利用彗星实验和微核实验结合的方法，测定了TCNM和BNM两种典型的HNMs作用于人类淋巴细胞 (lymphocyte) TK6的毒性大小。结果显示溴代物的毒性明显强于氯代物，同时DNA的损伤由氧化作用引起，并且不能转化为永久的遗传损伤。3.2.2 HANs 最新研究表明，HANs的毒性比同类的含碳消毒副产物例如HAAs要强许多12，同时随着新消毒方式的广泛应用，HANs作为改进的饮用水消毒方式产生的含氮DBPs的一种，其毒理学效应越来越受到人们的重视。早在1991年，Osgood31就对果蝇在HANs作用下的毒性效应进行研究，发现HANs具有诱变性和致癌性，同

23、时发现DCAN而非DBAN是黑腹果蝇卵母细胞非整倍体的有效诱导物。在1995年，Curieux等32对CAN、DCAN、TCAN、BAN、DBAN、BCAN这六种物质的毒性进行研究，首先采用SOS显色反应确定了DCAN、DBAN、BCAN三种物质对于E. coli PQ37的DNA损伤都存在一定程度的诱导作用，但响应值较低，可见SOS方法虽然简单快速，但其局限性在于对毒物敏感性较弱。其次，Curieux对S. typhimurium进行了Ames变异反应突变实验，以观察颜色的方法定性检测到CAN、DCAN、TCAN、BAN、BCAN这五种物质的诱变性，诱变能力大小排序为：DCAN BCAN B

24、AN TCAN CAN，这种方法较敏感，并且十分适于检测水样品的诱变性；最后，用微核实验检测到所有这六种物质均能对Pleurodeles waltl周边血液红细胞的染色体断裂产生效应。为了选用更合适的模式生物来模拟HANs作用于人体的毒性情况，Muellner6采用CHO AS52为模式细胞，运用测试细胞密度变化的毒性分析法和单细胞凝胶电泳两种方法系统分析了7种HANs作用于CHO的慢性细胞毒性和急性遗传毒性作用，细胞毒性大小次序为：DBAN IAN BAN BCAN DCAN CAN TCAN；遗传毒性大小次序为：IAN BAN DBAN BCAN CAN TCAN DCAN。从结果可以看出

25、细胞毒性和遗传毒性具有一定的相关性，并且碘代物的毒性要大于溴代物的毒性大于氯代物的毒性。3.2.3 HAcAms 2008年，Plewa15对13种HAcAms作用于CHO AS52的慢性细胞毒性和急性遗传毒性进行了比较研究，细胞毒性的大小次序为：DIAcAm（二碘乙酰胺） IAcAm（碘乙酰胺） BAcAm TBAcAm（三溴乙酰胺） BIAcAm（溴碘乙酰胺） DBCAcAm（二溴氯乙酰胺） CIAcAm（氯碘乙酰胺） BDCAcAm（溴二氯乙酰胺） DBAcAm BCAcAm （溴氯乙酰胺） CAcAm DCAcAm TCAcAm。 遗传毒性的大小次序为：TBAcAm DIAcAm IA

26、cAm BAcAm DBCAcAm BIAcAm BDCAcAm CIAcAm BCAcAm DBAcAm CAcAm TCAcAm。 DCAcAm没有遗传毒性。同年，Plewa等33通过试管哺乳细胞试验系统分析和对比了THMs、HAAs、HANs、HNMs和HAcAms等卤代DBPs的细胞毒性和遗传毒性，结果发现，上述卤代DBPs的细胞毒性由高到低依次为：HAcAms HNMs HANs HAAs THMs；遗传毒性由高到低依次为：HAcAms HANs HNMs HAAs THMs。可见HAcAms具有更高的致畸和致突变性。3.2.4 NMs随着亚硝胺类物质在消毒饮用水中的出现，它作用于人

27、体所产生的安全效应越来越受到关注，亚硝胺类物质也逐渐被认为是一种致癌物。而在亚硝胺类物质当中，二甲基亚硝胺(NDMA)是唯一在饮用水中被发现的化学物质，在九十年代，科学界关于亚硝胺类物质的所有研究重点几乎都集中于NDMA的存在和毒理学效应34。NDMA最早在加拿大安大略湖消毒饮用水中发现的浓度为0.3 g/L35，而最新的测定数据显示，NDMA在饮用水消毒之后的浓度一般不会超过10 ng/L36。而有关NDMA的毒理学研究，在1996年时，Couratier等37就对NDMA作用于神经细胞 (neural cells) 的急性和慢性毒性作用进行了相应的研究，采用了免疫印迹法，并且应用荧光显微镜

28、观察残存神经元数量来表征NDMA毒性大小，研究认为，NDMA的神经毒性作用可以导致神经元磷酸化和免疫反应。1999年，Taniguchi等38通过测定大鼠肝脏内的谷胱甘肽(GSH)和金属硫蛋白(MT)在暴露于NDMA一段时间之后含量的变化研究了NDMA对老鼠肝脏的氧化作用。结果显示，NDMA重复施毒所产生的氧化和肝毒素效应大于单剂量投药的效应。2010年，一项最新的研究39评估了亚硝基二乙胺(NDEA)和亚硝基二甲胺(NDMA)两种亚硝胺类物质作用于lymphocyte TK6的细胞毒性和遗传毒性作用。此实验首先测定了细胞暴露于NDMA和NDEA之后的稳定度来确定细胞毒性，其次采用单细胞凝胶电

29、泳测定DNA损伤，采用微核实验来测定染色体断裂等其他遗传损伤。结果表明NDEA和NDMA无论浓度的高低均不体现细胞毒性，而只有在添加了S9之后，NDMA在10 mM的高浓度下才能显示出遗传毒性，NDEA在5 mM浓度时显示出遗传毒性。3.3 消毒副产物的毒理学研究方法概况近三十年来，科学界对DBPs毒理学效应的研究正在不断深入，已有的毒理学研究也运用不同的受试生物和不同的检测方法阐述并比较了多种DBPs的毒理学大小。表2对这些毒理学研究方法进行了总结概括。表 2 DBPs的毒理学研究方法Table 2 Toxicology research methodologies of DBPs物质受试生

30、物测试方法测试指标文献C-DBPsTHMsmale rat F-344口头暴露ALT, AST, BUN, CRE, LDH, TPR, SDH, NAG13S. typhimurium RSJ100hisG46突变光谱G-C A-T20CHO AS52测细胞密度%C1/222单细胞凝胶电泳拖尾率HAAsS. typhimurium TA100Ames变异反应突变实验定性观察颜色24E.coli PQ 37SOS显色实验-牛乳糖甘酶和碱性磷酸酶活性Pleurodeles waltl微核实验红细胞微核数S. typhimurium TA100微孔板细胞毒性实验OD59525CHO AS52测细胞密度%C1/226单细胞凝胶电泳拖尾率人小肠上皮细胞 FH74测细胞密度%C1/227单细胞凝胶电泳拖尾率RT2-PCRDNA结合、修复，细胞周期调控与细胞凋亡N-DBPsHNMsS. typhimurium 致突变试验突变体的数量29CHO AS52测细胞密度%C1/21