原核诱导表达.docx

1、原核诱导表达 原核诱导表达的标准操作程序（SOP）一目的：使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。二适用范围：本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。三实验原理： E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控

2、区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。四、试剂准备:（一）实验器材的灭菌：枪头的灭菌：1mL，200L，20L的枪头放入枪头盒，

3、用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121，20min。80烘箱中烘干，常温放置。 螺口管及离心管的灭菌：将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放入高压灭菌锅中灭菌，121，20min。80烘箱中烘干，常温放置。50mL离心管的灭菌：将50mL离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121，20min。80烘箱中烘干，常温放置。（二）LB培养基的配制 液体LB培养基（1L）：蛋白胨 10g 氯化钠 10g 酵母提取物 5g 调PH值到7.5，高压灭菌，4保存。 固体LB培养基（1L）：蛋白胨 10g 氯化钠 10g 酵母提取物 5g 琼脂粉 15g

4、高压灭菌，不烫手的情况下加入抗性，抗性：培养基=1：1000（氨苄，卡那通常浓度），混匀。马上在无菌操作台中倒平板，并开大风吹干。用封口膜封住，倒置放于4保存。（三）1M IPTG的配制：经过计算，10g IPTG可以配42ml的1M IPTG。买来的粉末状的IPTG一般全部配成1M IPTG。1、无菌操作台紫外线照射，后通风。2、用少量去离子水将IPTG溶解完全，并定容。3、在无菌操作台中，用0.22m的滤器将配好的IPTG滤入灭菌后的1.5ml离心管中，过滤除菌，-20保存。注意事项：在用滤器将IPTG滤入离心管时，先用针头吸IPTG，然后将枪头拔掉，排出气体，滤头加入IPTG液，在使针管

5、与滤器相连，保证整个装置无气体进入。滤的过程中，手不能碰滤头。（四）3SDS-PAGE loading buffer的配制：3SDS-PAGE loading buffer10ml 1M Tris-Hcl (PH 6.8)1.5mlSDS0.6gBPB(溴酚蓝)30mg甘油（丙三醇）3ml去离子水5.5ml1将除BPB以外的药品完全溶解。SDS常温下很难溶解，可以在37水浴溶解。完全溶解后，再加入BPB，进行溶解。2把溶好的buffer分装到1.5ml的离心管中，1ml/管，常温放置。3使用前，每管加入30L巯基乙醇。注意事项：巯基乙醇为危险品，加入的过程在通风橱中完成，并且带好手套。（五）1

6、0PBS的配制：0.1M PBS（10PBS）1LNaH2PO4.2H2O2.83gNacl85gNa2HPO4.12H2O28.98g用去离子水将以上药品进行溶解。（溶解的非常慢，可能需要过夜）调PH值到7.2，用0.4m的滤膜过滤。常温保存。工作时用的是1PBS。（六）1.5M Tris-Hcl (PH 8.8) 的配制：1.5M Tris-Hcl250mlTris45.425g 1 用200ml去离子水将Tris溶解。2用浓盐酸调PH值到8.8。3调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。40.4m的滤膜过滤，常温保存。注意事项：Tris的缓冲能力很强，调PH值时，费些时间，但不要调过

7、。（七）1M Tris-Hcl (PH 6.8) 的配制：1M Tris-Hcl250mlTris30.275g 1用200ml去离子水将Tris溶解。2用浓盐酸调PH值到6.83调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。40.4m的滤膜过滤，常温保存。（八）30%丙烯酰胺的配制：30%丙烯酰胺250ml丙烯酰胺72.5 mlBIS甲叉丙烯酰胺2.5 ml1把药品用去离子水溶解后定容到250ml。2用滤纸过滤，放在棕色瓶子中，4保存。注意事项：两种药品有毒性，配制过程要带手套和口罩。（九）10%SDS的配制：11g SDS加入10ml去离子水进行溶解。2分装到1.5ml离心管中，-20保存。

8、（十）10%过硫酸铵的配制：11g 过硫酸铵加入10ml去离子水进行溶解。2分装到1.5ml离心管中，-20保存。（十一）5SDS-PAGE电泳缓冲液的配制：5SDS-PAGE电泳缓冲液1LTris15.1gGlycine（甘氨酸）94gSDS5g将以上药品用去离子水溶解后定容到1L，常温保存。工作时用的是1SDS-PAGE电泳缓冲液。（十二）考马斯亮蓝R-250染色液的配制：考马斯亮蓝R-250染色液 1L 1 往1g考马斯亮蓝R-250中加入250ml异丙醇，在磁力搅拌器上搅拌六小时以上。2 加入650ml去离子水，磁力搅拌器搅拌过夜。3 再加入100ml冰醋酸进行溶解，磁力搅拌器搅拌。4

9、 在通风橱内用滤纸进行过滤。常温保存。染色液只能反复用两次。注意事项：在磁力搅拌器上搅拌时，要把容器封口。（十三）脱色液的配制：脱色液1L醋酸（冰乙酸）100ml乙醇（无水乙醇）50ml去离子水850ml常温保存。四实验步骤： （一）：质粒的转化 1使用无菌操作台之前先用75%的酒精擦拭，然后将灭菌的培养基以及所有要用到的器具放到超净台上，在开紫外照射30min左右。操作之前，关掉紫外，打开通风橱，将手用酒精擦拭后开始操作。2从-80的冰箱中取出表达菌（BL21）的感受态细胞（每管100L），在-80冰水中融化。3载体（PET32a等）与基因片段的连接后质粒1L，缓慢的加入到100L BL21

10、感受态中，冰置15min。（无菌操作）342下热激90s，随后在冰水中冰置5min。4涂板：先将涂布棒用酒精棉球擦，然后用酒精灯火焰烧，放置等它凉却。把处理后的感受态点在含有抗性的固体培养基（氨苄或卡那等）上。用冷却的涂布棒进行涂布，左手把该盖拿起，小指轻轻转动培养基，右手来涂，涂到培养基表面快干。（无菌操作）5放在37培养箱中，倒置培养过夜。注意事项：1质粒的转化时，质粒是冻在-20的冰箱中，等它完全化了在进行吸取，往感受态中加入质粒时，一定要缓慢，因为感受态非常脆弱，防止感受态受伤。2质粒的转化时，热激的时间90s，一定要控制好时间。3质粒的转化时，涂布棒在涂布前，一定要晾凉涂布棒。防止感

11、受态被烫死，或固体培养基的损坏。（二）：挑菌与接菌：1无菌操作台紫外线照射，后通风。将转化后的平板取出。2在无菌操作台中，把消毒后的螺口管（一般一个基因取四个螺口管，进行平行实验）取出，在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。3灭菌后的LB培养基从冰箱中取出，在酒精灯的外焰上烧一下培养基瓶口。吸取LB培养基（一般5.5mL）加入螺口管中，后加入抗性（氨苄霉素、卡那等）。氨苄霉素（卡那）：LB培养基=1:1000（5.5L），抗性由载体决定。4镊子用酒精棉球擦拭，并在酒精灯的外焰上灼烧，将镊子晾凉。用晾凉的镊子，夹取20L小枪头，在转化后的平板上挑取单菌落，扔到培养基中。5接好菌的螺口管，进行摇菌。37

12、，180rpm。摇到菌的对数期（OD600值0.4-0.6），时间大概2-3h。可以模糊看到手即可。（注意不要摇过）6用完的平板用封口膜封住，倒置放于4保存。7若直接用菌液进行接菌，接菌比例为，菌液：LB培养基=1：100。注意事项：1 接菌吸培养基时，把放置培养基的三角瓶倾斜才吸取培养基，移液枪尽量不要插进三角瓶中。2接菌时一定要加入抗性，挑菌落时，要挑单个的菌落，且不要把培养基也扣起来。3摇菌不要过了它的对数期，2小时后随时注意其生长状态。（三）小量保菌：1无菌操作台紫外线照射，后通风。2将摇到标准OD值的菌液进行小量保菌，先在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。3保菌：从灭菌的饭盒中取出4个1

13、.5ml的灭菌的离心管，加入50L的灭菌后的80%的甘油，并分别加入相应的350L菌液。一个基因的四个平行实验菌都要进行保菌。（若不保菌，实验不能进行重复，只能从头做）4标清保菌的类别，名称，时间，如“BL21 PET32a VAV 1号2010.7.14”,其中的1号是平行对照中它排几号。5混匀，-20保存。注意事项：1在小量保菌中，一个基因的四个平行对照都要保菌，否则得重新摸条件。2在小量保菌中，菌液与甘油一定要混匀在保存，否则菌会被冻死。（四）蛋白诱导表达条件摸索1无菌操作台紫外线照射，后通风。2小量保菌后的四个平行实验组，分别加入不同终浓度的IPTG，在不同的温度条件下进行诱导（如下图

14、）：对照编号IPTG终浓度诱导温度诱导温度1号1 mmol/L3h372号0.1 mmol/L3h373号1 mmol/L3h304号0.1 mmol/L3h30（五）小量收菌1将诱导完成的四个平行实验组菌液，分别取出1mL，对应装于4个不同的1.5ml离心管中并做好标记。剩余的平行实验组菌液放入4保存。2离心7000rpm，2min，使菌沉淀。3把上层培养基倒掉，用1ml 1PBS把表达菌重悬，再次离心7000rpm，2min，使菌沉淀。4把上层1PBS倒掉，再次离心同步骤3。5用80L 1PBS把表达菌体重悬。6在四个平行的重悬液中，分别加入80L 3SDS-PAGE loading bu

15、ffer。（把3SDS-PAGE loading buffer当成2SDS-PAGE loading buffer用）7煮样8min。（打开锅盖煮）8离心13000rpm,10min。吸上清。9进行SDS-PAGE电泳。注意事项：在煮样时要打开锅盖煮，防止小样进水，若样进水，则不能再用。（六）SDS-PAGE胶的配制1分离胶的配制（1）找出配套的胶板，用擦镜纸擦干净，并固定在配胶器上。随后用去离子水试漏。（2）若胶板不漏水，就进行分离胶的配制。依次将水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl（PH 8.8）、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中（如下图），混匀。（1mm的胶板，一

16、般配一块胶用5ml。所配的胶浓度一般为12%，但浓度也要视情况而定。蛋白越小，胶的浓度越大。）（3）将胶板中的水倒掉，并用滤纸吸干水分（不要将滤纸塞到胶板底部）。（4）小烧杯中再加入TEMED，混匀。（TEMED可使胶凝固，所以最后加）（5）灌胶：混匀的分离胶沿着胶板边缘轻轻灌下，防止产生气泡。（6）用水将分离胶压平。（用水灌满，同时加水时要缓慢加入，防止把胶吹起）2浓缩胶的配制（1）待分离胶与水中间形成明显的横线，即分离胶凝固。随后进行浓缩胶的配制，依次将水、30%丙烯酰胺、1.0M Tris-Hcl（PH 6.8）、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中（如下图）(2) 将分离胶上

17、层的水倒掉，并用滤纸吸干水分。（尽量不要把滤纸插入）（3）小烧杯中再加入TEMED，混匀。 （4）灌胶。然后插入梳子。 （5）把制胶器倒过来，胶仍然不会往外流，或可以明显看出梳子中两个齿之间的胶面明显凹下去，说明浓缩胶凝固。将凝固的胶板装入电泳槽内，并在电泳槽内加入SDS-PAGE电泳缓冲液，把胶浸泡一段时间，时间越长越好。（防止梳子与胶相连，或胶因湿度不够而萎缩）（6）点样时，再把梳子拔出来，拔时动作要轻，防止胶齿被拔断。（七）未诱导和空载的制备在诱导表达中，有两个重要的对照组，即空载诱导和未诱导。1未诱导的制备（1）未诱导是我们所做一个基因除了四个平行实验外，再做的一个对照组菌，唯一不同的

18、是它不进行诱导（接菌步骤如上），在37下，进行摇菌，不加IPTG，摇起来即可。（和表达完的菌浓度差不多即可）（2）未诱导的菌进行小量处理，见上面的小量收菌。2空载诱导的制备（1）空载的转化：将不连基因片段的空载体质粒，转入表达菌（和前面的试验用一个表达菌），如“BL21-PET32a-VAV质粒”转入“BL21表达菌”，其空载应当是“BL21-PET32a”转入“BL21表达菌”。转化步骤同上。（2）空载接一个菌（实验组），并摇菌摇到对数期（步骤同上）。（3）空载的诱导： 空载的诱导条件固定为温度37，时间3h. ，IPTG终浓度为1mmol/L。（诱导步骤如上）。（4）空载的菌进行小量处理，

19、见上面的小量收菌。（八）蛋白诱导表达条件摸索的SDS-PAGE电泳1拔掉SDS胶上的梳子，并用小针调整齿的位置（使它们都平行）。2点样。用20L的小枪头，吸煮过的样品10L，对准胶孔点样，注意不要把样品点在外面。我们用的marker是低分子量蛋白marker。一般的点样顺序是：1234567空载未诱导样品1号样品2号样品3号样品4号marker3开始电泳，电泳仪正负极接好，打开电源。浓缩胶：电压 low 100V分离胶：电压 high 150V。4卸胶染色。等胶内的所有的蓝色都跑出去，电泳停止，一般时间为1小时45分。把胶板从电泳仪上卸下，用刀片把胶板撬开，胶的浓缩胶部分割除，放入考马斯亮蓝R

20、-250染色液中进行常温过夜染色。5脱色。将过夜染色的SDS-PAGE胶放入脱色液中进行脱色，直到背景发白。（九）四个平行实验组菌液的选择1将脱好的胶拿出进行观察，看四个平行实验组菌液是否进行了蛋白表达。一般来说，未诱导没有过量的蛋白表达，而空载有一处蛋白的过量表达（大小由表达载体决定），四个平行实验组也有一处蛋白的过量表达，它比空载表达的蛋白要大，大出的那一部分即我们的目的蛋白。2若平行实验组中无过量蛋白表达，尤其是37，1mmol/L，3h无过量蛋白表达，则说明蛋白无表达。3若平行实验组中有过量蛋白表达，但它的大小与空载的大小相同。这说明蛋白进行了漏表达。4若蛋白表达正常，则选择诱导温度最

21、低，IPTG浓度最低的实验组（30，0.1 mmol/L，3h），进行下面的小量超声实验。（十）表达菌的小量超声实验1把以上做的四个平行实验组菌液从4中拿出。2将最有条件的实验菌全部收集在1.5ml的小离心管中。（其他平行实验组的菌进行灭菌）3离心7000rpm，2min，使菌沉淀。4把上层培养基倒掉，用1ml 1PBS把表达菌重悬，再次离心7000rpm，2min，使菌沉淀。5把上层1PBS倒掉，再次离心同步骤3。6用500L 1PBS把表达菌重悬。7将菌液放入小玻璃管中，准备进行超声。8将超声仪打开预热20min，并准备冰盒。9将呈菌液的小玻璃管放入冰盒进行超声，超声效率为3050HZ，超

22、声3s，停5s。直到菌液超澄清（透明呈现鸡蛋清色）。 10将超开的菌液进行离心，13000rpm，10min。11离心产物上清取出100L，加入100L3SDS-PAGE loading buffer。12上清倒掉，沉淀用1ml 1PBS把表达菌重悬，再次离心13000rpm，10min。13重复11步。14上清倒掉，用100L将沉淀悬起，加入100L3SDS-PAGE loading buffer。15上清和沉淀都进行煮样，开锅盖，8min。16离心13000rpm,10min。吸上清。17进行SDS电泳。注意事项：1小样超声时，要超彻底，一般超45分钟即澄清。若仍然不澄清，则可能是包涵体。

23、超的过程中不要超糊。2在洗超声离心物的沉淀时，要洗干净。（十一）破菌超声的SDS-PAGE电泳1配胶、点样、电泳的步骤如上。破菌超声的点样顺序一般为：123456marker未诱导空载全菌破菌上清破菌沉淀未诱导，空载，全菌为摸索表达条件时所用的样品。注：我们破的几号菌，就上几号的全菌样。2若破菌上清表达的蛋白与全菌的蛋白分子量一致（目的蛋白），且破菌沉淀中没有，这说明蛋白可溶；若破菌沉淀中有目的蛋白，而破菌上清中没有，说明蛋白为包涵体。（十二）目的蛋白的大量表达（1L）1配制培养基1L，每大瓶500ml，高压灭菌4保存。2一级接菌：摸索完条件的表达菌进行接菌3管，每管5ml。抗性：培养基=1:

24、1000,菌液：培养基=1:100。（菌液为针对可溶条件的小量保菌液）步骤如上。37，120rpm，过夜摇菌。3标准保菌：100L灭菌甘油加入700L过夜菌。混匀，-20保存。（写好名称日期，如上，放入表达菌的库中）3二级接菌：对大瓶进行接菌，抗性：培养基=1:1000，菌液：培养基=1:100。即每瓶5ml。4摇菌：37，180rpm，摇到对数期，摇到菌的对数期（OD600值0.4-0.6），时间大概2-3h。可以模糊的看到手即可。（注意在摇过程中随时观察状态，不要摇过）5诱导：依据摸索好的条件进行诱导。（十三）大量诱导的收菌：150ml离心管灭菌烘干，待用。2找出两个50ml离心管，管盖和

25、管壁上做标记，并称重。36个50ml离心管（包括称重的两个），倒入菌液（4045ml）。配平，离心7000rpm，10min。4倒掉上清，用1PBS把菌重悬，离心7000rpm，10min。5重复4。6倒掉上清，称菌体的重量。7悬菌。1g菌体加入35ml的纯化时用的上样缓冲液悬起。-20保存。（十四）大量表达菌的超声1把表达菌从-20拿出，在流水中融化。2把完全融化的表达菌，放入小烧杯中准备超声。3将超声仪打开预热20min，并准备冰盒。4将呈菌液的小烧杯放入冰盒进行超声，超声效率为3050HZ，超声3s，停5s。直到菌液超澄清，呈现鸡蛋清色。（一般超20-30min，注意不要吵时间太长，使菌

26、超糊）5将超开的菌液进行离心，13000rpm，10min。6将上清收集在灭菌的50ml离心管中，进行纯化。五促进原核表达的蛋白可溶的方法：一般来说，人们认为包涵体的形成是因为新生多肽链不能在正确位置形成二硫键，二硫键错配， 进而错误折叠的结果。而IPTG浓度越低，温度越低，一般蛋白的可溶性越大，因为这样的条件下，可以减慢蛋白的形成，减少蛋白的二硫键错配，从而促进蛋白的可溶。1使蛋白可溶的条件并不是固定的，一般来说，以上条件就可是蛋白可溶（有时2/4条件可以把IPTG浓度提的高一点）。但如果仍不可溶的话，可以试一下0.025mmol/L，常温，过夜诱导。这种条件是IPTG使用量的最小浓度，可以

27、使包涵体部分可溶。2 180rpm摇菌摇对数时，不要摇过。对数期时，是表达菌产蛋白的最佳时期。表达菌浓度太大，对菌中蛋白的可溶性影响会很大。所以在摇菌到2h后，一定密切关注菌的浓度，随时用分光光度计测OD600值。这就意味着在接菌时，多接一些菌（由实际情况而定）。3蛋白的可溶与表达菌也有关系。菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21 系列 就是lon 和ompT 蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。BL21(DE3)即我们做表

28、达是常用的表达菌。真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法，Rosetta 2 系列就是更好的选择 这种携带pRARE2质粒的 BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及CGG）稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。（已经携带有氯霉素抗性质粒）当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K-12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin

29、 reductase (trxB)和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。（卡那霉素敏感）Rosetta-gami 2 则是综合上述两类菌株的优点，既补充7种稀有密码子，又能够促进二硫键的形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。（卡那霉素敏感）Origami B 是衍生自 lacZY突变的 BL21菌株，这个突变能根据IPTG的浓度精确调节表达产物，使得表达产物量呈现IPTG浓度依赖性。（四环素敏感）在决定试用这些名字古怪的菌株时，有几个小Tips是要注意的，一个是不同菌株有时

30、已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性，要注意自己的表达质粒是否能与之兼容。比如Rosetta 2 已经携带有氯霉素抗性质粒，不能再用氯霉素筛选等等。现象可能原因改进方案建议菌株无蛋白表达E. coli 的密码子偏移性补充稀有密码子的tRNA；将稀有密码子突变为普通大肠杆菌密码子Rosetta 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami BRosettaBlue出现截短蛋白包涵体二硫键形成困难降低宿主胞质的还原性；利用促进二硫键形成的各种载体标签Origami 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami B表达过快，表达量过高控制优化表达水平：降温，IPTG浓度优化TunerRosetta-gami B蛋白无活性蛋白错误折叠降低宿主胞质