基因工程.docx

1、基因工程基因工程1：论述题名词解释1、DNA重组；2、克隆；3、DNA克隆；4、目的基因；5、基因载体；6、质粒；7、基因工程；8、载体；9、转化；10、感染；11、转导；12、转染；13、DNA变性；14、DNA复性；15、退火；16、DNA芯片；17、错义突变18、基因诊断；19、限制性核酸内切酶；20、基因文库；21、cDNA文库；22、RFLP；23、核酸探针；24、转录 参考答案：1、DNA重组：是指用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程。2、克隆：原指一个亲本细胞经无性繁殖产生无数个相同细胞的子代群体的过程。3、DNA克隆：是指将重组DNA分子导入

2、到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的相同的DNA分子，又称分子克隆或基因克隆。4、目的基因：要分离和克隆的相应基因常称为目的基因。因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内进行复制或表达，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因或外源性DNA。5、基因载体：能够携带外源DNA进入受体细胞内进行复制或表达的DNA分子，被称为基因载体。6、质粒：是独立于细菌染色体之外，能自主复制的共价闭合环状双链DNA。7、基因工程：有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。8、载体：能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。9、

3、转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。10、感染：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。11、转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。12、转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。13、DNA变性：在物理或化学因素的作用下，导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。14、DNA复性：当促使变性的因素解除后，两条DNA链又可以通过碱基互补配对结合形成DNA

4、双螺旋结构。15、退火：指将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链。16、DNA芯片：DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。17、错义突变：DNA分子中碱基对的取代，使得mRNA的某一密码子发生变化，由它所编码的氨基酸就变成另一种的氨基酸，使得多肽链中的氨基酸顺序也相应的发生改变的突变。18、基因诊断：以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、结构缺陷或表

5、达异常，对人体的状态和疾病作出诊断的方法和过程。19、限制性核酸内切酶：是由细菌产生的一类能特异识别双链DNA中的特定碱基序列，并在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶)。20、基因文库：将所有的重组DNA分子都导入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。21、cDNA文库：从组织细胞中分离得到纯化的mRNA，然后以mRNA为模板，利用逆转录酶合成其互补DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后导入受体菌内，扩增，构建cDNA文库。22、RFLP：即限制性片段长度多态性，个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。若因此而改变了限制性内切

6、酶的酶切位点则可导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称为RFLP。23、核酸探针：探针是指能与某种大分子发生特异性相互作用，并在相互作用之后可以检测出来的生物大分子。核酸探针是指能识别特异碱基顺序的带有标记的一段DNA或RNA分子。24、转录：在合成蛋白质过程中，三类RNA都 必须以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚合酶催化下合成，包括RNA链的起始、延伸和终止等环节，此一系列过程就叫转录，即RNA的合成。1：单选题构建基因组DNA文库时，首先要分离细胞的（ ）。 A：染色体 DNAB：线粒体 DNAC：总 mRNAD：tRNA参考答案：A2：单选题已知某一内切酶在一个环状DNA上有

7、4个切点，当用此酶切割该环状DNA，可以得到（ ）个片段。A：3B：4C：5D：6参考答案：B3：单选题关于 PCR 技术的叙述，下列哪项是错误的？（ ）。 A：以 DNA 复制为基础而建立起来的技术B：利用 PCR 技术可完全无误地扩增基因C：反应体系需模板、一对引物、4种dNTP、耐热DNA 聚合酶和缓冲溶液D：以变性-退火-延伸为一周期参考答案：B4：单选题关于 DNA 接头在基因工程中的作用，下列说法中哪一项不正确（ ）A：给外源 DNA 添加适当的切点B：人工构建载体C：调整外源基因的可读框D：增加调控元件参考答案：D5：单选题以下关于简并引物的描述中，正确的是（ ）A：简并引物是根

8、据已知 DNA 序列设计的引物群B： 简并引物是根据已知蛋白质的氨基酸序列设计的引物群C： 设计简并引物不需要考虑密码子的偏爱性D： 简并引物与普通的 PCR 引物是相同的参考答案：B6：单选题用碱法分离质粒 DNA 时，染色体 DNA 之所以可以被除去，是因为（ ）A：染色体 DNA 断成了碎片B：染色体变性后来不及复性C：染色体 DNA 分子量大，难以释放D：染色体未同蛋白质分开而沉淀参考答案：B7：单选题下列哪一种酶作用时需要引物（ ）A：末端转移酶B：反转录酶C：DNA 连接酶D：限制性内切酶参考答案：B8：单选题在分子生物学领域，重组 DNA 又称（ ） A：酶工程B：DNA 工程C

9、：细胞工程D：基因工程参考答案：D9：单选题用于鉴定转化子细胞是否含重组 DNA 的最常用方法是（ ） A：抗性标记选择B：分于杂交选择C： RNA 反转录D：免疫学方法参考答案：A10：单选题下面有关限制酶的叙述哪个是错误的（ ）A：限制酶是外切酶而不是内切酶B：同一种限制酶切割 DNA 时留下的末端序列总是相同的C： 一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链 DNA ，产生粘末端D：一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链 DNA ，产生平末端参考答案：A11：单选题下列哪一项不是 Southern blotting 的步骤（ ） A：用限制酶消化 DNAB：DNA 与载体的连接C：凝胶

10、电泳分离 DNA 片段D：DNA 片段转移到硝酸纤维膜上参考答案：B12：单选题下列 DNA 聚合酶中，哪一种酶只切割双链 DNA 中的一条链，产生单链切口，即切口酶（ ）A：DnaseB：Klenow DNA 聚合酶C：T4 噬菌体 DNA 聚合酶D：T7 噬菌体 DNA 聚合酶参考答案：A13：单选题基因组代表一个细胞或生物体的（ ） A：部分遗传信息B：整套遗传信息C： 可转录基因D：非转录基因参考答案：B14：单选题以下关于表达载体叙述不正确的是（ ）A：必须具备很强的启动子B：必须具备很强的终止子C：启动子不需要受控制D：所产生的 mRNA 必须具有翻译的起始信号参考答案：C15：单

11、选题迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（ ）A：既可以作用于双链 DNA ，又可以作用于单链 DNAB：只能作用于单链 DNAC：只能作用于双链 DNAD：只能作用于 RNA参考答案：C16：单选题SDS 是分离 DNA 时常用的一种阴离子去污剂，下列对其作用描述不正确的是（ ）A：溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂，亦可以溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来B：对Rnase、Dnase有一定的抑制作用C：与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性沉淀D：消除反应中的泡沫参考答案：D1：论述题简答题1、常用的工具酶有哪些？其主要用途是什么？2、重组DNA技术常包括哪些基本步骤：3、常用的目

12、的基因的获取方法有哪些？4、常用的目的基因与载体的连接方法有哪些？5、解释质粒，为什么质粒可作为基因载体。6、YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?7、为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？8、列举质粒载体必须具备的4个基本特性。 9、PCR的基本原理是什么？10、用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？11、cDNA克隆与基因组克隆有何不同？12、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去？13、试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？14、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？15、什么叫基因工程（Gene Engineering），试从理论和技术两个方面谈谈

13、基因工程诞生的基础？16、抗性基因是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？17、分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？参考答案：1、答：（1）限制性核酸内切酶：识别并特异切割DNA碱基序列；（2）DNA pol：催化缺口平移，制备高比度DNA探针；（3）Klenow片段：合成cDNA第二条链，补齐或标记双链DNA3端；（4）TaqDNA聚合酶：DNA体外扩增(PCR)；（5）逆转录酶：催化合成cDNA；(6) T4DNA聚合酶：聚合补平或标记DNA平末端或3凹端等；（7）DNA连接酶：催化2条DNA链之间形成磷酸二酯键；（8）大肠杆菌DNA连接

14、酶： 应用于黏端DNA或切口间连接；（9）T4DNA连接酶：应用于黏性或平末端DNA的连接；（10）末端脱氧核苷酸转移酶：给载体或cDNA加上互补的同聚尾、加标记物；（11）碱性磷酸酶：防止载体自身连接、32P标记5端；（12）T4多核苷酸激酶：5端磷酸化、5端标记放射性核素。2、答：（1）分离制备目的基因分”；（2）切割目的基因和载体切”；（3）目的基因与载体的连接接”；（4）将重组DNA导入宿主细胞转”；（5）筛选并鉴定含重组DNA分子的受体细胞克隆筛”；（6）克隆基因在受体细胞内进行复制或表达表”。 3、答：（1） 制备基因组文库；（2） 构建cDNA文库；（3） PCR扩增目的基因；（

15、4） 人工合成DNA技术。4、答： 黏性末端连接：将靶基因片段和载体DNA经相同的限制酶分别切割，使它们两端产生相同的黏性末端。然后经黏性末端碱基配对，再经DNA连接酶作用，共价连接成新的重组DNA分子； 平头末端连接：将平末端的DNA分子在T4DNA连接酶催化下，使DNA分子的3OH和5P进行共价结合； 人工接头法： 是指利用人工接头加在平端DNA片段的两端，然后用相应限制酶切割人工接头以产生黏性末端，再与带相同黏性末端的载体相连； 同源多聚尾连接法：在末端脱氧核苷酸转移酶催化下，在线型载体分子的两端加上单一核苷酸如dG组成的多聚尾；而在目的DNA分子的两端加上dC尾，两者混合退火，然后经D

16、NA聚合酶或Klenow填补裂口处缺失的核苷酸，再通过DNA连接酶修复成环状的双链DNA。5、答：质粒是独立于细菌染色体之外，能自主复制的共价闭合环状双链DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，而且质粒含有复制起始原点(ori)，此起始点与顺式作用调控元件构成一个复制子(复制区内)，能借助宿主细菌染色体DNA复制所用的同一套酶系独立地进行自我复制、克隆。6、答： YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。7、答：YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移

17、距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。8、答： (1)独立复制； (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。9、答：DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。10、答：至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。11、答： 基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子。12、答：化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。13、答：外因：反应条件、底物纯度、反应温度和

18、限制性内切酶本身的活性；内因：位点偏爱性；甲基化；底物的构象。14、答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）；必须具备合适的酶切位点，供外源 DNA 片段插入，同时不影响其复制；有一定的选择标记，用于筛选；其它：有一定的拷贝数，便于制备。15、答：基因工程（Gene Engineering ）又称基因操作（Gene Manipulation）、重组 DNA 。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA 分子），按预先设计的蓝图，在体外构建杂种 DNA 分子，然后导

19、入活细胞，以改变生物原先的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。理论上的三大发现和技术上的三大发明均在20世纪70年代完成，因而基因工程技术可以说是20世纪70年代诞生的。16、答：氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（kanr , neor）以及琥珀突变抑制基因 supF 。青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。 Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化 -内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核

20、糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。17、答：琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片断大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从 200bp 至近 50kb 的 DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段 DNA （5-500bp）效果较好，其分辨力极高，甚至相差 1bp 的 DNA 片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的 DNA ，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电

21、泳装置进行 DNA 电泳。1：论述题论述题1、何谓限制性核酸内切酶？写出大多数限制性核酸内切酶识 DNA 序列的结构特点。2、什么是Western印迹？它与Southern印迹有什么不同？3、什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?4、如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因?参考答案：1、答：限制性核酸内切酶(RE)是由细菌产生的一类能特异识别双链DNA中的特定碱基序列，并在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶)。限制酶的识别和切割位点通常是48个bp长度且具有回

22、文序列的DNA片段，主要产生5突出、3突出的黏性末端或平端。当一个样本DNA被一个特定的限制酶切割后，可以产生一批相同碱基序列的DNA片段，进而可以用于基因重组、克隆、核酸分子杂交与序列分析等。2、答： Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。3、答： 基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段 的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体，包括下列过程：(1)高分子量染色体DNA的制备；(2)体外重组连接；

23、(3)包装蛋白的制备；(4)重组体的体外包装；(5)将重组DNA导人寄主细胞；(6)筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。4、答： 可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。1、基因工程的定义与特征。定义：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA

24、），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。特征：1、具跨越天然物种屏障的能力。 2、 强调了确定的DNA片段在新寄主细胞中的扩增。2、试述基因工程的主要研究内容。1）、目的基因的分离2）、DNA的体外重组（载体、受体系统等）3）、重组DNA分子转移到受体细胞及其筛选4）、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。3、基因工程在食品工业上有何应用发展？主要是通过基因重组，使各种转基因生物提高生产谷氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提高利用价值。4、转基因是一把双刃剑，请客观谈

25、谈对转基因及转基因食品安全性的认识。转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种；第二，延长食品保存时间或增加营养成分；第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力， 减少了农药的使用量，有利于环境保护；第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物， 产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。转基因作物的大面积种植已有数年，

26、 食用转基因食品的人群至少有10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可， 食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。第一章 DNA的分子特性与利用1、 原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？1）原核基因表达调控的三个水平：转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控原核基因表达调控主要是在转录水平上的调控。2）真核生物基因表达的特点： 1基因组DNA存在的形式与原核生物不同； 2真核生物中转录和翻译分开进行； 3基因表达具有细胞特异性或组织特异

27、性； 4真核基因表达的调控在多个水平上进行：DNA水平的调控、转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控； 2、 什么是基因？根据基因的产物，基因可分为哪三类？基因是具有生物学功能的、在染色体上占据一定位置的一段核苷酸序列，是分子遗传的功能单位。根据基因的产物，基因可分为三类： 转录并翻译编码蛋白质的基因: 包括结构蛋白基因、编码酶的基因、调节基因 转录但不翻译产物的基因: 包括tRNA、rRNA 不转录但有功能的DNA区段: 如启动子、操纵基因3、 引起核酸变性的因素主要有哪些？核酸变性后性质有何变化？引起核酸变性的因素：-温度、酸、碱、甲醛和尿素等。DNA变性后，它的

28、一系列性质发生变化，如紫外吸收(260 nm)值升高（增色效应）, 粘度降低等，如DNA增加2540%. RNA约增加1.1%。4、 DNA复性及其影响因素。变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关，也与它本身的组成和结构有关：分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。（附加：注意：将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。复性的应用：核酸的杂交，分子扩增）第二章 基因工程操作的基本技术1. DNA凝胶电泳中核酸分子分离的机理。 在碱性环境下，核酸分子带

29、负电荷，在外加电场的作用下，分子在凝胶多孔性刚性滤孔中从负极向正极泳动，其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同大小核酸分子的目的。2. DNA凝胶电泳中影响电泳迁移率的因素主要有哪些？1）分子本身的影响 分子的大小：小则快 带电荷数：多则快 分子构型：超螺旋解螺旋2）电场：直流电场 电压高则快 电压太高则结果不准确常用35V/CM3）支持物介质 种类：琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 凝胶浓度: 浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；浓度小，筛孔大，适合大分子电泳4）电泳缓冲液 pH值：偏碱性，带负电荷 离子浓度：离子浓度高 电流大发热快胶溶解 种类：TAE、TBE、TPE、TNE3. PCR的原理

30、和主要反应过程，并分析影响PCR扩增的影响因素。PCR原理：变性温度下， DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。影响PCR扩增的影响因素：(1)Taq酶：常用1U/25L 浓度低，扩增产物不够； 浓度高，非特异性扩增增加； 酶的活性；(2)dNTP的浓度：常用100-200mol/L，不能低于20mol/L，特异性、保真性；(3)模板：主要考虑纯度及使用量，对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等

31、杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng.(4)引物浓度：0.1-0.5mol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体；(5)Mg2+浓度：常用 0.5-2.5mmol/L； 影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性(6)PCR反应程序设定：变性温度和时间、引物退火温度Tm与时间、引物延伸温度与时间和循环数4. PCR引物设计的原则，若给一指定DNA序列并需要通过PCR扩增此序列，如何设计扩增引物？（关于如何设计这个问题，靠自己了）引物设计原则： 1、G+C含量45-55%； 2、Tm值高于55； 3、引物特异性； 4、引物扩增跨度； 5、是否形成引物二聚体5. 定量PCR的原理？Ct值的含义。原理：通过