浅论ezrin和merlin基因在胰腺癌细胞中的表达及其意义.docx

1、浅论ezrin和merlin基因在胰腺癌细胞中的表达及其意义浅论ezrin和merlin基因在胰腺癌细胞中的表达及其意义【摘要】 目的： 研究ezrin和merlin基因在胰腺癌细胞中的表达情况及其对胰腺癌细胞生物学行为的影响。方法： 应用RT PCR与Western blotting 检测ezrin和merlin基因在胰腺导管上皮细胞及胰腺癌细胞中的mRNA 和蛋白表达水平;利用脂质体分别将ezrin和merlin基因转染入SW1990细胞株中，应用MTT实验、流式细胞术、迁移实验和细胞黏附实验观察转染基因对细胞增殖、迁移和黏附能力，细胞周期及凋亡的影响。结果： ezrin和merlin基因

2、在8株细胞中均有不同程度的表达，其表达水平与胰腺癌细胞的分化程度无关。与对照组相比，转染ezrin和merlin基因的SW1990细胞增殖速度缓慢();细胞周期表现为G1 期细胞增多,S期细胞减少(均);细胞与基质的黏附能力明显下降();且转染merlin的SW1990细胞其迁移能力亦有明显降低(),而转染ezrin的SW1990细胞其迁移能力无明显统计学意义的改变()。结论： ezrin和merlin蛋白在胰腺癌细胞增殖、进展过程中可能发挥着负性调节作用。【关键词】 胰腺癌; ezrin基因; merlin基因; 增殖; 迁移ezrin蛋白是埃兹蛋白、根蛋白和膜突蛋白(ezrin radix

3、in moesin, ERM)家族成员之一, 与merlin蛋白同属于 蛋白超家族成员。人ERM 之间有75%80% 的同源性,人merlin 与ERM蛋白仅有45% 的同源性1。ezrin与merlin蛋白主要定位于与细胞骨架重塑有关的区域，如细胞膜的皱褶、动力微丝以及卵裂沟等部位，主要参与上皮细胞中细胞骨架与胞膜之间的连接，具有维持细胞形态和运动、连接黏附分子及调节信号转导等功能。大量研究表明,ezrin蛋白作为近年在肿瘤侵袭和转移研究中的相关蛋白，在很多肿瘤组织中都有异常表达,并与促肿瘤侵袭转移有关。merlin蛋白是第一个被发现具有肿瘤抑制作用的蛋白质，研究发现当其编码基因发生突变时，

4、merlin蛋白失活, 其生长抑制功能丧失, 最终导致肿瘤的形成。关于ezrin和merlin蛋白在胰腺癌中的研究，国内外报道较少。本实验的研究目的是通过观察ezrin和merlin蛋白在胰腺癌细胞中的表达情况，来探讨它们之间可能存在的关系，以及分别转染野生型ezrin和merlin基因后各自对对方的影响和对肿瘤细胞生物学行为的影响，为以后这两种蛋白的临床应用打下一定的基础。1 材料与方法材料细胞系和质粒 人胰腺导管上皮细胞系HPDE和人胰腺癌细胞系COLO357、SW1990、PANC1、CAPAN1、CAPAN2、CFPAC1和BXPC3为本实验室所保存，用含有10%胎牛血清(杭州四季青生

5、物工程材料有限公司)的RPMI 1640培养基，在37 、5% CO2培养箱中培养。+HA、+HA ezrin和+HA merlin质粒由德国美因茨大学苏占海博士惠赠。试剂 质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司;逆转录 多聚酶链反应(RT PCR)试剂盒购自Toyobo公司;鼠抗人ezrin单克隆抗体购自Santa Cruz Biotech公司;兔抗人merlin单克隆抗体及鼠抗人HA单克隆抗体购自Cell Signaling Tech公司;G418购自Sigma公司;脂质体Lipofectamine 2000及Trizol购自Invitrogen公司。实验方法逆转录聚合酶链反应(RT PCR)

6、检测ezrin和merlin基因mRNA表达水平 Trizol试剂提取细胞总RNA ,经逆转录获得cDNA。取2 l质粒行PCR反应。ezrin基因引物：上游为5 ATGCCGAAACCAATCAATGT 3，下游为5 GGCCAAAGTACCACACTTCC 3,扩增片段大小为139 bp。merlin基因引物：上游为5 ACCGTTGCCTCCTGACATAC 3，下游为5 GGCCTCGATTTCTGTCTTGA 3,扩增片段大小为178 bp。G3PDH基因引物：上游为5 ACCACAGTCCATGCCATCAC 3，下游为5 TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3,扩增片段大小

7、为450 bp。引物根据GenBank中所查到的ezrin和merlin全基因序列应用Primer Premier 软件自行设计，由Invitrogen公司合成。PCR反应体系50 l。反应条件：94 预变性2 min;98 变性10 s，45 (ezrin)/47 (merlin)/60 (G3PDH)退火30 s，68 延伸1 min，共33个循环;68 延伸10 min。取4 l产物%琼脂糖凝胶电泳、照相。Western blotting检测ezrin和merlin蛋白表达 取对数生长期的8株细胞(HPDE、COLO357、SW1990、PANC1、CAPAN1、CAPAN2、CFPAC

8、1和BXPC3)和3株转染后细胞(SW1990 HA、SW1990 ezrin和SW1990 merlin)，提取总蛋白质,样品蛋白浓度测定按试剂盒说明书进行,每泳道加40 g总蛋白行SDS PAGE 蛋白电泳并将蛋白转至PVDF膜;一抗分别为鼠抗人ezrin单克隆抗体、兔抗人merlin单克隆抗体 (11 500)和抗人 actin多克隆抗体(13 000) , 4 孵育过夜;漂洗后滴加HRP标记的二抗(110 000)室温孵育2 h,以ECL试剂盒显色,Western blotting检测结果应用BIO RAD公司的Quantitive one软件进行分析,计算条带的光密度比值,实验重复3

9、次。质粒转染 在6孔板中每孔接种3105个SW1990细胞，培养至生长密度为80%时，用脂质体按说明书进行转染。实验分未转染组(空白对照组)、转染空白质粒组(阴性对照组)和转染阳性质粒组。质粒转染48 h后，换含500 gml-1 G418的选择培养基培养，7 d后空白对照组细胞全部死亡，换含100 gml-1 G418的选择培养基维持筛选至细胞密度达到70%80%时，转至新的培养瓶中继续培养。噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖 分别选取对数生长期的4组细胞(SW1990、SW1990 HA、SW1990 ezrin和SW1990 merlin)，以5103孔-1的细胞数接种于96孔板中。分别在培

10、养1、2、3、4 d后，每孔加入MTT溶液(5 mgml-1)20 l,继续培养4 h后终止培养，吸干孔内培养液，每孔加入150 l DMSO，震荡至结晶充分溶解，选择492 nm波长，在酶标仪上测吸光度(A)值。以时间为横轴，细胞增殖率(=A实验组/A空白对照组 100%)为纵轴绘制细胞生长曲线。流式细胞仪分析细胞周期 分别选取对数生长期的4组细胞，用70%乙醇溶液于-20 固定过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，依次加入50 gml-1碘化丙啶和1 mgml-1RNase A，室温避光孵育30 min后上机检测。Transwell细胞迁移实验 分别选取对数生长期的4组细胞，消化计数，Tra

11、nswell(购自美国BD公司，孔径为8 m)上室加入细胞密度为1105 ml-1含%BSA的无血清培养基200 l，24孔板下室加入含10%胎牛血清的培养基500 l，培养箱培养12 h后弃去室内培养液，PBS冲洗2遍，用棉签轻轻擦去基底膜上室细胞，按95%乙醇15 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min程序固定，再用苏木精染色5 min，伊红染色30 s，清水冲洗3遍，晾干后于高倍镜下(400)计数细胞并拍照。每组做3次，取均值。细胞 基质黏附实验 按照司徒镇强等的方法进行操作。分别用未转染组细胞(SW1990)、空质粒转染组细胞(SW1990 HA)和转染组细胞(SW1990

12、 ezrin和SW1990 merlin)按2104孔-1接种于包被有质量浓度为50 gml-1 Matrigel 的96 孔培养板, 每组设置4个平行孔, 用RPMI 1640 完全培养基置于37 、5%CO2培养箱内孵育。分别在培养1 h和2 h后，按MTT比色法测定各孔细胞的光吸收值(A值)，按以下公式计算黏附率黏附率(%)=A实验组/A空白对照组 100%。统计学方法数值用x-s表示,应用SPSS 软件进行方差分析、t检验，以为差异有统计学意义。2 结 果ezrin和merlin基因在不同细胞中的mRNA表达情况电泳结果显示，在所检测的胰腺导管上皮细胞(HPDE)和7种不同胰腺癌细胞中

13、均有3条特异性扩增条带,且条带位置与预期相符。ezrin mRNA在PANC1、CAPAN1和HPDE细胞中具有较高的表达水平，在SW1990细胞中中度表达，在COLO357、CFPAC1、BXPC3和CAPAN2细胞中表达水平偏低。merlin mRNA表达水平在COLO357、HPDE、PANC1和CAPAN2细胞中表达较高，在SW1990、CAPAN1、CFPAC1和BXPC3表达较低(图1)。图1 ezrin和merlin基因的mRNA在细胞中的表达ezrin、merlin蛋白在胰腺导管上皮细胞和不同胰腺癌细胞中表达情况Western blotting 结果显示，ezrin蛋白在PAN

14、C1、CAPAN1和HPDE细胞中具有较高的表达水平，在COLO357、SW1990、CFPAC1和BXPC3细胞中中度表达，在CAPAN2细胞中表达水平较低。merlin蛋白除在CAPAN1和BXPC3细胞中表达水平稍低外，在HPDE和COLO357、SW1990、PANC1、CAPAN2、CFPAC1细胞中均有较高的表达水平。ezrin和merlin蛋白表达情况在正常胰腺导管上皮细胞和恶性胰腺癌细胞中无明显的差异，且其表达水平与胰腺癌细胞的分化程度无关(图2)。转染前后SW1990细胞ezrin和merlin蛋白表达水平的变化Western blotting 结果显示，与未转染组和空白质粒

15、转染组相比，阳性质粒(+HA ezrin)转染组(SW1990 ezrin)ezrin蛋白表达水平明显升高()，而merlin蛋白表达情况无明显差异()。同样，阳性质粒(+HA merlin)转染组(SW1990 merlin)merlin蛋白表达水平明显升高()，而ezrin蛋白表达情况无明显差异()(图3)。ezrin和merlin蛋白抑制胰腺癌细胞的增殖生长MTT结果显示，与未转染组(SW1990)和空白质粒转染组(SW1990 HA)相比，阳性质粒转染组(SW1990 ezrin和SW1990 merlin)细胞增殖受到明显抑制，细胞生长速度明显下降()，且merlin蛋白比ezrin

16、蛋白有更强的作用效果(), 未转染组和空白质粒转染组相比无明显差异()(图4)。图4 转染前后SW1990细胞增殖能力的变化ezrin和merlin基因转染对SW1990细胞周期和凋亡的影响流式细胞仪分析显示，与未转染组细胞和空白质粒转染组相比，转染ezrin和merlin基因后的细胞G0/G1期细胞比例明显增加()，S期比例减少()，且merlin较ezrin基因对细胞周期的影响要强;转染基因对转染细胞凋亡无明显的影响。表1 ezrin和merlin基因转染前后SW1990细胞周期分布和凋亡的变化ezrin和merlin蛋白的过度表达对胰腺癌细胞迁移能力的影响显微镜下对转移到Transwel

17、l小室膜另一侧的细胞观察计数，未转染组细胞SW1990、空白质粒转染组细胞SW1990 HA、阳性质粒转染组细胞SW1990 ezrin和SW1990 merlin细胞迁移个数分别为、和，转染ezrin基因后的细胞其迁移能力无统计学意义的改变(),而转染merlin基因后的细胞其迁移能力明显降低，有统计学意义()。转染后细胞SW1990 ezrin和SW1990 merlin较SW1990细胞与基质黏附能力下降通过实验发现，与未转染组细胞和空白质粒转染组相比，转染后细胞SW1990 ezrin和SW1990 merlin与基质黏附能力在60 min和120 min均有明显下降()，而未转染组和

18、空白对照组之间细胞黏附率差异无统计学意义(),转染组细胞SW1990 ezrin和SW1990 merlin之间，基质黏附能力亦无明显差异()(图5)。图5 转染前后SW1990细胞基质粘附能力的变化3 讨 论ezrin和merlin同为细胞骨架蛋白，其结构具有较高的同源性，均包含氨基端球形膜结合区(FERM)、伸长的 螺旋区、带正电的羧基末端3个结构域，所不同的是merlin蛋白羧基端缺少F 肌动蛋白的结合位点。尽管存在着结构上的同源性，但关于它们两者在肿瘤中的研究显示，它们可能各自发挥着不同的功能，甚至可相互竞争抑制，发挥相反的功能。ezrin蛋白的表达水平与多种恶性肿瘤的分化程度、恶性程

19、度及侵袭存在着联系，如乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、肝癌、胃癌等，在许多类型的恶性肿瘤中存在着突变和表达异常。研究发现,ezrin蛋白在高度恶性骨肉瘤中的表达水平比低度恶性骨肉瘤高3倍，而在卵巢癌中其表达水平与肿瘤的恶性程度成负相关。另有研究发现，通过降低ezrin蛋白在子宫内膜癌细胞中的表达后，肿瘤细胞的侵袭、转移能力明显下降，而ezrin蛋白在结直肠癌上皮细胞中的表达水平受到抑制后，可增加肿瘤细胞的侵袭转移能力。关于ezrin蛋白研究发现，在不同的细胞和组织类型中其发挥的作用也不尽相同，其功能很可能具有细胞和组织特异性。Akisawa等10在1999年的研究发现，ezrin蛋白的高表达预示着

20、胰腺癌细胞具有更高的转移能力。而在本实验，通过基因转染使胰腺癌细胞SW1990过表达ezrin蛋白后发现，转染后肿瘤细胞与未转染组和空白质粒转染组相比，迁移能力并无明显的升高。ezrin蛋白发挥作用主要是通过磷酸化激活后产生，所以我们考虑转染ezrin基因后的细胞，其迁移能力无明显改变的原因可能是由于ezrin总蛋白水平提高，而磷酸化的水平并无明显改变所引起的。然而，值得一提的是，在实验中我们发现转染后细胞SW1990 ezrin与未转染组和空白质粒转染组相比，其与基质的黏附能力却表现出了明显的下降，这应该是有活性的ezrin蛋白发挥作用引起的。针对以上的研究情况，我们提出以下三种可能：1)e

21、zrin蛋白是作为细胞运动相关蛋白的下游效应因子存在，它可被细胞运动相关蛋白激酶磷酸化而获得活性，与肌动蛋白相结合介导细胞运动。实验中，尽管我们提高了ezrin蛋白表达量，但因细胞内其它相关蛋白激酶表达量并未发生变化，致使ezrin蛋白磷酸化水平也未发生改变，因此细胞的运动能力也未发生改变。2)未被磷酸化的闭合状态下的ezrin蛋白同样具有功能活性，虽不能结合与细胞运动有关的蛋白(如肌动蛋白)，但可与某些黏附分子相结合，来介导细胞的黏附。3)活化的ezrin蛋白与其它细胞运动、黏附相关蛋白之间有结合能力强弱之别，两者之间ezrin蛋白首先结合细胞黏附相关蛋白，调节细胞 细胞以及细胞 基质的黏附

22、，总的趋势是，使肿瘤细胞间的同质性黏附能力增强，而使肿瘤细胞与基质之间的异质性黏附能力减弱。另外本实验还发现，转染ezrin基因后的细胞与未转染组和空白质粒转染组相比，其生长增殖能力明显地降低，提示我们ezrin蛋白除与肿瘤细胞的迁移和黏附能力相关外，与肿瘤细胞的生长增殖也有着密切关系。因此我们需要对ezrin蛋白在肿瘤细胞中的作用进行更加详细的研究，包括ezrin蛋白活化机制和具体的结合蛋白等，而不是仅仅简单地把它作为一个肿瘤治疗的靶位点来看待。merlin蛋白由肿瘤抑制基因NF2编码而来，在肿瘤的发生、发展进程中发挥着负性调节作用，目前这种观点得到一致的认同。而在我们本次实验中也证实，转染

23、merlin基因后的肿瘤细胞与未转染组和空白质粒转染组相比，其生长、增殖和迁移能力，以及细胞与基质黏附附能力均表现出明显的降低，这与目前merlin蛋白在其它类型肿瘤细胞和组织中的功能研究相一致。由于ezrin和merlin蛋白在结构上存在着同源性，而在发挥生物学功能上面存在着差异(ezrin蛋白在磷酸化后发挥作用，而merlin蛋白在去磷酸化时发挥作用)，于是我们猜想它们在表达水平之间可能存在着相互影响。通过实验我们发现，高表达ezrin蛋白的转染后细胞，与未转染细胞和空白质粒转染细胞相比，其merlin蛋白的表达水平未发生明显改变。同样的情况也发生在过表达merlin蛋白的转染后细胞ezr

24、in蛋白表达情况上，结果提示我们，ezrin蛋白和merlin蛋白可能各自发挥作用，又或许其相互的关系主要体现在蛋白的活化和失活，以及与其它蛋白的结合能力方面，而不表现在表达量方面。【参考文献】 1VAHERI A,CARPEN O,HEISKA L,etezrin protein family: membrane cytoskeleton interactions and disease associationsJ.Curr Opin Cell Biol,1997,9:659 666. GUSELLA J F,RAMESH V,MACCOLLIN M,et :the neurofibroma

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