106成品纯度RPHPLC分析方法验证方案0723.docx

1、106成品纯度RPHPLC分析方法验证方案0723起草人/日期Prepared by /Date：审核人部门日期批准人/日期Approved by/Date：一、目的：1. 证明该方法适用注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品纯度的测定。2. 验证注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品纯度测定的RP-HPLC方法的可靠性和有效性。二、范围：1. 适用于注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品纯度测定的RP-HPLC分析方法验证。三、责任：部门职责QC负责方法验证方案的起草，验证有关的培训，分析仪器的操作及原始数据的记录，起草验证报告。QC经理负责方法验证方案和报告的审核，协调指导该项验证工

2、作。QA 负责审核验证方案和验证报告，组织开展验证工作，协调验证实施。QA经理负责方法验证方案、报告的审核。负责验证文件的保存归档。质量管理负责人负责方法验证方案和报告的批准。四、分析方法描述：1. 仪器和色谱柱1.1 HPLC泵：二元或二元以上梯度洗脱泵1.2 HPLC检测器：UV检测器或二极管阵列检测器。1.3色谱柱：C4，4.6250mm，孔径300或相同规格的色谱柱1.4 操作条件1.4.1流动相：A：0.1%TFA的水溶液B：0.08%TFA的乙腈溶液1.4.2 流速：0.7mL/min1.4.3 检测波长：280nm1.4.4 柱温：4021.4.5 样品温度：421.4.7 上样

3、量：1mg/ml，20 L1.4.8 按下表进行梯度洗脱，必要时调整流动相比例，使主峰保留时间约为16分钟，主峰前后的相关蛋白与之分离度不小于1.5。No.Time/minA (%)B (%)1070302370303205545425505052601006300100731703084170301.5 结果计算按峰面积归一法计算，主峰及其相关蛋白峰面积应不低于总面积的98%，主峰面积应不低于95%。五、方案培训：1. 验证开始前首先由起草人对相关人员进行方案培训，按照培训管理规程的规定进行记录，并将培训记录的复印件纳入验证报告的附件。六、验证内容：1. 相关确认1.1 仪器确认：确认相关仪

4、器、设备经过校验，在校验合格期内。记录表格见附件一表1。1.2 色谱柱确认确认色谱柱的规格，序列号。记录表格间附件一表2。1.2 试剂、标准品和样品确认确认所用试剂、标准品和样品规格和纯度符合要求，在有效期内。记录表格见附件一表3，4。1.3 人员培训确认：确认操作人员接受了高效液相色谱仪方法操作培训。2. 验证程序项目包括：系统适用性、专属性、检测限、精密度和溶液稳定性。2.1 系统适用性2.1.1 目的测定该分析方法的系统适用性。2.1.2 溶液配制2.1.2.1 空白溶液：超纯水2.1.2.2 辅料溶液：称取柠檬酸三钠二水合物220.0mg，乙二胺四乙酸二钠盐二水合物20.0mg，氯化钠

5、818.0mg，聚山梨酯800.105g，加超纯水90ml溶解，用柠檬酸调节pH至6.50.5，再加超纯水定容至100ml。参照系统适用性溶液配制的稀释倍数对上配制的辅料再进行稀释，混匀，10000r/min离心6min，取上清。2.1.2.3 系统适用性溶液：取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品适量，用超纯水稀释至每1ml中含蛋白1.0mg的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。2.1.3 方法精密量取空白溶液，辅料溶液和系统适用性溶液各20l，注入液相色谱仪，记录保留时间、分离度。将记录表格和原始图谱纳入验证报告。2.1.4 可接受标准主峰与相邻杂质分离度大于1.5，

6、。2.1.5 记录表格样式，见附件二2.2 专属性实验2.2.1 目的证明该方法在辅料，杂质，降解产物等存在下，能正确测定出被测物。2.2.2 溶液配制2.2.2.1 空白溶液：超纯水2.2.2.2 辅料溶液：称取柠檬酸三钠二水合物220.0mg，乙二胺四乙酸二钠盐二水合物20.0mg，氯化钠818.0mg，聚山梨酯800.105g，加超纯水90ml溶解，用柠檬酸调节pH至6.50.5，再加超纯水水定容至100ml。参照样品溶液配制的稀释倍数对上配制的辅料再进行稀释，混匀，10000r/min离心6min，取上清。2.2.2.3 样品溶液：精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品适量，

7、用超纯水稀释至每1ml中含蛋白1.0mg的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。2.2.2.4 理化对照品溶液：精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂理化对照品适量，用超纯水稀释至每1ml中含蛋白1mg的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。2.2.3 方法2.2.4 可接受标准2.2.5 记录表格样式，见附件三2.3检测限（LOD）2.3.1 目的测定该分析方法的杂质检测限。2.3.2 溶液配制2.3.2.1 空白溶液：超纯水2.3.2.2 检测限溶液：取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品适量，用超纯水稀释至每1ml含蛋白1mg的溶液，10000r

8、/min离心6min，取上清，然后逐步稀释至最小杂质信噪比为23。2.3.3 方法精密量取检测限溶液，由高浓度到低浓度各20l注入液相色谱仪，计算最小杂质的信噪比，最小杂质的信噪比为23时，该浓度即为最小杂质检测限对应溶液浓度。将记录表格和原始图谱纳入验证报告。2.3.4 可接受标准LOD对应的最小杂质的信噪比为23。2.3.5 记录表格样式，见附件四2.4 精密度2.4.1 目的测定该分析方法下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。2.4.2 溶液配制2.4.2.1 空白溶液：超纯水2.4.2.2 样品溶液：精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品适量，用超纯水稀

9、释至每1ml含蛋白1.0mg的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。2.4.3 方法2.4.3.1 重复性精密量取样品溶液20l注入液相色谱仪，由一名分析员重复进样6次，记录主峰面积和保留时间，计算主峰峰面积和保留时间的相对标准偏差。将记录和原始图谱纳入验证报告。2.4.3.2 中间精密度由两分析员用同种方法新鲜配制样品溶液，每天一人，连续三天按照空白溶液1针、样品溶液连续6针的顺序进行进样，进样量20l。记录主峰的峰面积和保留时间，计算6针样品的主峰平均峰面积和平均保留时间，根据3天的平均值计算相对标准偏差。将记录表格和原始图谱纳入验证报告。2.4.3 可接受标准可接受标准为

10、峰面积的RSD不大于2.0%，保留时间的RSD不大于1.0%。2.4.5 记录表格样式，见附件五2.5 耐用性2.5.1 目的考察测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的程度。2.5.2 溶液稳定性2.5.2.1 溶液配制2.5.2.1.1 空白溶液：超纯水2.5.2.1.2 样品溶液：精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品适量，用超纯水稀释至每1ml含蛋白1.0mg的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。2.5.2.2 方法样品溶液保存在4，精密量取20l样品溶液，分别在0h，2h，4h，8h，12h进样，记录样品纯度。2.5.3 色谱柱耐用性2.5.3.1溶液配制

11、2.5.3.1.1 空白溶液：超纯水2.5.3.1.2 样品溶液：精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品适量，用超纯水稀释至每1ml含蛋白1.0mg的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。2.5.3.2 方法取两根相同型号，规格，不同批号的色谱柱，精密量取20l样品溶液，注入色谱仪，每根色谱柱重复测定3次，计录主峰的纯度和保留时间，计算3针样品的主峰平均纯度和平均保留时间，根据两色谱柱测定的主峰平均纯度和平均保留时间平均值计算相对标准偏差。将记录表格和原始图谱纳入验证报告。2.5.4 可接受标准2.5.4.1 溶液稳定性样品溶液在规定时间内样品纯度的RSD不大于2.0

12、%。2.5.4.2 色谱柱耐用性主峰纯度的相对平均偏差不大于2.0%，主峰保留时间的相对平均偏差不大于1.0%。2.5.5 记录表格样式，见附件六十、缩写与定义：MV 是 Method Validation（方法验证）的缩写。LOD 是Limit of Detection（检测限）的缩写。十一、参考文件：1. 现行版中国药典二部 附录XIX A 药品质量标准分析方法验证指导原则2. 美国FDA分析方法验证指南3. ICH. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. Q2 (R1). 4. 生物制品质量控制分析方法验证技

13、术审评一般原则十二、附件：1. 相关确认记录 MV-12-009A12. 系统适用性记录 MV-12-009A23. 专属性记录 MV-12-009A34. 检测限记录 MV-12-009A45. 精密度记录 MV-12-009A56. 耐用性记录 MV-12-009A6表1：仪器确认表仪器名称厂家型号编号校验有效期至HPLC移液器（100-1000l）移液器(10-100l)移液器(2-20l)水浴锅备注：执行人/日期：复核人/日期：表2：色谱柱确认表厂家规格SN备注：执行人/日期：复核人/日期：表3：试剂确认表 试剂名称规格批号有效期至三氟乙酸乙腈柠檬酸三钠二水合物氯化钠乙二胺四乙酸二钠二

14、水合物聚山梨酯-80无水柠檬酸备注：执行人/日期：复核人/日期：表4：标准品或样品确认表样品名称规格批号来源注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂理化对照品注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品备注：执行人/日期：复核人/日期：系统适用性1 样品制备1.1 空白溶液：超纯水1.2 辅料溶液：称取柠檬酸三钠二水合物 g，氯化钠 g，乙二胺四乙酸二钠二水合物 g，聚山梨酯-80 g，加超纯水 ml溶解，用柠檬酸调节pH至 ，再加超纯水水定容至 ml。再精密量取上述溶液 l，加超纯水 l混匀，10000r/min离心6min，取上清。1.3 样品溶液：精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品

15、 l，加超纯水 l，稀释成1.0mg/ml溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。2 方法精密量取空白溶液，辅料溶液和样品溶液各20l，注入液相色谱仪，记录主峰保留时间，分离度。将记录表格和原始图谱纳入验证报告。色谱峰保留时间分离度123456可接受标准：主峰相邻杂质与其分离度1.5结论：备注：执行人/日期：复核人/日期：专属性1 样品制备1.1 空白溶液：超纯水1.2 辅料溶液：称取柠檬酸三钠二水合物 g，氯化钠 g，乙二胺四乙酸二钠二水合物 g，聚山梨酯80 g，加超纯水 ml溶解，用柠檬酸调节pH至 ，再加超纯水水定容至 ml。在精密量取上述溶液 l，加超纯水 l混匀，10

16、000r/min离心6min，取上清。1.3 样品溶液：精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品 l，加超纯水 l，稀释制成含蛋白1.0mg/ml溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。1.4 理化对照品溶液：精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂理化对照品 l，加超纯水 l，稀释制成含蛋白1.0mg/ml溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。看样品主峰与理化对照品保留时间是否一致，空白溶液、辅料，杂质和主峰间是否有干扰。将记录表格和原始图谱纳入验证报告。样品与理化对照品主峰保留时间（min）样品：理化对照品：样品纯度，杂质和主峰间分离度样品：可接受

17、标准：样品主峰与理化对照品保留时间一致，空白溶液，辅料无干扰，杂质，降解产物等和主峰间无干扰结论：备注：执行人/日期：复核人/日期： 检测限（LOD）1 样品制备1.1 空白溶液：超纯水1.2检测限溶液：精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品 l，加超纯水 l，稀释制成含蛋白1.0mg/ml溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清，逐步稀释至最小杂质信噪比为23。2 方法精密量取检测限溶液，由高浓度到低浓度各20l注入液相色谱仪，计算最小杂质的信噪比。将记录表格和原始图谱纳入验证报告。溶液浓度（mg/ml）信噪比（S/N）123456可接受标准：最小杂质的信噪比为23结论

18、：备注：执行人/日期：复核人/日期：精密度1 样品制备1.1 空白溶液：超纯水1.2 样品溶液：精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品 l，加超纯水 l，用超纯水稀释制成含蛋白1.0mg/ml的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。2 方法 2.1 重复性精密量取样品溶液20l注入液相色谱仪，重复进样6次，记录主峰面积和保留时间，计算主峰峰面积和保留时间的相对标准偏差。将记录和原始图谱纳入验证报告。进样次数保留时间（min）主峰面积123456平均值RSD可接受标准：RSD1.0%RSD2.0%结论：备注：执行人/日期：复核人/日期：2.2 中间精密度由两分析员用同种

19、方法新鲜配制样品溶液，每天一人，连续三天精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品 l，加超纯水 l，稀释制成含蛋白1.0mg/ml的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。按照空白溶液1针、样品溶液连续6针的顺序进行进样，进样量为20l。计录主峰的峰面积和保留时间，计算6针样品的主峰平均峰面积和平均保留时间，根据3天的平均值计算相对标准偏差。将记录表格和原始图谱纳入验证报告。分析员1： 分析员2： 天数次数主峰面积保留时间（min）1（分析员1）2（分析员2）3（分析员1）1（分析员1）2（分析员2）3（分析员1）123456平均值RSD接受标准RSD2.0%RSD1.0

20、%结论：备注：执行人/日期：复核人/日期：耐用性1 溶液稳定性1.1 溶液配制1.1.1 空白溶液：超纯水1.1.2 样品溶液：精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品 l，加超纯水 l，稀释制成含蛋白1.0mg/ml的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。1.2 方法样品溶液保存在4，精密量取20l样品溶液，分别在0h，2h，4h，8h，12h进样，记录样品纯度。将记录和原始图谱纳入验证报告。时间纯度0h2h4h8h12h纯度平均值RSD可接受标准RSD2.0%结论：备注：执行人/日期：复核人/日期：2 色谱柱耐用性2.1 溶液配制2.1.1 空白溶液：超纯水2.1.

21、2 样品溶液：精密量取注射用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂成品 l，加超纯水 l，稀释制成含蛋白1.0mg/ml的溶液，混匀，10000r/min离心6min，取上清。2.2 方法取两根相同型号、规格，不同批号的色谱柱，精密量取20l样品溶液，注入色谱仪，每根色谱柱重复测定3次，计录主峰的纯度和保留时间，计算3针样品的主峰平均纯度和平均保留时间，根据两色谱柱测定的主峰平均纯度和平均保留时间平均值计算相对平均偏差。将记录表格和原始图谱纳入验证报告。色谱柱1 SN：色谱柱2 SN：检测项目纯度（%）保留时间（min）色谱柱1212进样次数123123123123结果平均值相对平均偏差可接受标准相对平均偏差2.0%相对平均偏差1.0%结论：备注：执行人/日期：复核人/日期：