掺假牛羊肉的鉴定.docx

1、掺假牛羊肉的鉴定摘要肉类是我国居民消费最大的食品之一,然而掺假事件时有发生,这不仅对消费者的经济利益造成损害,，更有甚者会对人类身体健康造成影响,因此对肉类掺假进行检测鉴别显得十分重要。目前,国内外最常用的检测方法有PCR检测技术、电子舌电子鼻法、近红外光谱技术、色谱技术等。本研究将在这里，我们将利用三类方法对肉类进行鉴定：一、根据动物细胞中细胞色素b基因的序列保守性，设计并合成种属特异性引物，用PCR扩增技术得到肉和肉制品的目标DNA片段，通过荧光定量PCR技术，根据目标DNA片段的大小的不同来判断肉和肉制品种类。二、根据仿生学原理，利用电子鼻和电子舌中对不同物质敏感程度不同的传感器对肉中特

2、有的气味和味道信号的辨别和收集，通过软件优化后采用主成分分析法来对不同肉种类加以区分。三、通过对光谱信息分析而提取出物质的特征信息的近红外光谱技术结合主成分分析法对不同动物来源肉进行分析。三种方法均能够快速、准确的判断肉和肉制品的种类，且检测成本都较低，通过三种技术的强强联合为行业检测肉类提供了强有力的技术保障。我们不但能将假肉区分开，还可以检测出肉中的掺假比例。关键词：PCR扩增，qPCR，电子舌，电子鼻，近红外光谱技术，掺假肉类鉴别AbstractMeat consumption is one of the largest food, but have occurred adulterat

3、ion, which not only cause damage to the economic interests of consumers, worse impact on human health, so the meat adulteration detecting identification is very important. At present, domestic and foreign most commonly used detection methods are PCR detection technology, electronic tongue electronic

4、 nose method, near infrared spectroscopy, chromatography technology. This study will be here, we will use three kinds of meat identification methods: First, based on sequence conservation of animal cells, the cytochrome b gene was designed and synthesized species-specific primers by PCR amplificatio

5、n techniques to get meat and Meat target DNA fragments by quantitative PCR, depending on the size of the target DNA fragments to determine the type of meat and meat products. Second, according to the principle of bionics, the use of electronic nose and electronic tongue sensitivity to different subs

6、tances different sensors to identify and collect meat unique smell and taste signals, after the adoption of software to optimize the use of principal component analysis to different types of meat distinction. Third, through the analysis of spectral information and feature information extracted subst

7、ances near infrared spectroscopy combined with principal component analysis of meat from different species were analyzed. Three methods are able to quickly and accurately determine the type of meat and meat products, and testing costs are low, through the powerful combination of three techniques for

8、 detecting the meat industry to provide a strong technical support. We not only can distinguish fake meat, can also detect adulteration of meat ratio.Keywords: PCR amplification，qPCR，smartnose，smartongue，NIRS，identification of adulterated meat目录摘要 1Abstract 2目录 31 文献综述 11.1 课题背景 11.2 研究现状 11.3 研究意义

9、11.4 文献综述 21.5 研究方案确定 52 实验流程和方案依据及原理说明 62.1 分子生物学部分 62.1.1 基因组抽提 62.1.2 引物设计原理 62.1.3 PCR原理 72.1.4 琼脂糖凝胶电泳原理 82.1.5 QPCR原理 82.2 仿生生物学部分 82.2.1 电子鼻检测原理 82.2.2 电子舌检测原理 92.2.3 近红外光谱定性分析原理 103 实验方法 113.1 实验材料 113.2 实验仪器 113.3 细胞破碎 123.4 EZUP柱式动物组织基因抽提 12 3.5 PCR步骤.17 3.6 QPCR操作步骤及数据处理.183.7 电子鼻操作步骤 183

10、.8 电子舌操作步骤 193.9 电子鼻、电子舌数据处理 193.10 近红外光谱定性分析操作步骤及数据处理 204结果与讨论 214.1 PCR检测分析掺假肉类 214.2电子鼻鉴定结果.31 4.3 电子舌鉴定结果 314.4 近红外光谱定性分析结果 335 结论与展望 335.1结论 345.2展望 34参考文献 36致谢 391 文献综述1.1 课题背景跨入21世纪以后，出现了很多肉类掺假的问题，例如在2011年被发现的牛肉浸膏事件，2012年底在欧洲发生的“马肉风波”，2013年在中国餐饮业发现的羊肉掺假事件。这些案例让消费者们非常担忧现在的食品安全市场以及担忧肉类行业的混乱局面，而

11、消费者们的担心必然会引发政府监管部门力度的加强。除了掺假事件外在2011年新华网还曝光了一起关于多地用牛肉膏浸制造假牛肉的事件，这起事件让我们认识了一种新型添加剂，它是国际组织公认的天然香精，有真实的牛肉风味。在记者的暗访中，他亲身体验把猪肉加添加剂后变成牛肉的过程，经过牛肉膏浸泡的猪肉单从外形和口感上很难与真牛肉作区分，一些简单的方法也难以对他们进行鉴别，导致消费者和监管部门束手无策。在巨大的市场利益下，许多小门面餐饮店和黑作坊都开始利用这种方式生产假牛肉。现在新鲜猪肉价格大概为10元/500克，牛肉大概为17元/500克，那么一次作假25公斤猪肉就可以节省约350元，很大程度上诱惑了无良商

12、家。在国外，一些发达的国家和地区也有肉类掺假事件的发生。在2012年末，英国、法国和瑞典一部分牛肉制品中检测到了马肉，德国也发布了公告称发现了“挂牛头卖马肉”的情况。除了上述几个国家外，爱尔兰、罗马尼亚、荷兰等多个欧洲国家也同时被卷入这场风波中，引起了消费者的反感。1.2 研究现状上述肉类掺假实例影响极为恶劣，让我们不得不重新审视肉类品种的鉴别方法。目前检测食品和饲料中的动物源成份的方法主要有以显微镜观察为基础的方法；以检测蛋白质为基础的方法，例如通过蛋白的提取来判断种类和新鲜度；以检测DNA为基础的方法，例如PCR特异性扩增技术，qPCR技术；依靠仿生学原理的方法，例如电子鼻和电子舌的新手段

13、；以及通过对光谱信息的分析而提取出物质的特征信息的近红外光谱技术。以DNA为基础的检测方法又分为：核酸探针杂交、PCR-RFLP分析、DNA指纹分析和PCR特异扩增。其中以PCR特异扩增最为简便、准确、灵敏，在实际应用中最为广泛。PCR-RFLP分析法中使用的限制性内切酶对PCR产物进行酶切分析有诸多不便；指纹分析中DNA指纹操作难度相对较大，故这两种DNA检测的方法在实际检测中都较少应用，且鉴别方法繁琐，耗时较长。1.3 研究意义根据近几年内，聚合酶链反应（PCR）方法被开发了出来，用于植物、动物的识别和认证。这是一种基于核酸的方法，具有更好的特异性，可靠性，比蛋白质为基础的技术更灵敏。而定

14、量实时PCR具有快速，经济，易于使用的，具体的，重复性好，敏感度高等优点。此外，整个扩增过程可以被跟踪。因此将该项技术运用于肉类物种鉴定是具有发展前景的。电子鼻和电子舌是一种对电子传感信号进行收集后数据化的新技术，在对食品质量进行评定，或者质量管控和微生物检测方面都显现出了他们独特的优势，这两种新仪器对于产品过程的检测和对于产品加工工艺的跟踪上都有很好的灵敏性。随着不断的开发和研究，将电子鼻和电子舌和其他的仪器进行联用可以让检测结果更加有说服力，更加系统化，有利于对产品质量检测时让数据有信服力。总而言之，在这两种分析技术优势基础上，联合利用其它分析技术可取得更加详尽的分析结果，而这种耦合技术将

15、会成为一种新的研究趋势。近红外光谱技术作为一项快速、无损的绿色环保技术，必将有一个好的应用前景。在肉的等级鉴别、不同品种鉴别、不同物种鉴别以及不同饲喂方式、不同产地的鉴别研究可行，并且预测效果较好。但近红外光谱技术对于不同等级、品种、物种、产地在测量前需要建立模型。一个应用预测模型的应用，必须与建模前所用的基质相一致，否则不能得到较好预测。在今后的研究中，扩大建模范围，增加模型覆盖面以及研究领域，近红外光谱应用将会更加广泛。本研究中qPCR的意义在于运用合适的引物，摸索出最适合的实验条件，优化实验过程，最终能得出一套高效、快速、简洁的方案，准确的检测出肉类的含量和种类。电子鼻、电子舌及红外光谱

16、技术的研究是开发新仪器的使用，并利用它们检测肉种类，并对比三种方法优势，相互取长补短，为市场提供一套行之有效的方法便于肉类管理和检验检测，还消费者一个放心。1.4 文献综述1.4.1 肉类鉴定方法的发展和趋势目前几乎所有的无损检测技术采用相对单一的检测方法，与传统的信号预处理技术和模式识别方法。它往往是一个两个指标有更好的响应信息，但充分利用各种信息进行综合评价时就会显现出一定的劣势。由于肉类成分的复杂性,其质量涉及多个指标。所以将几种技术的有机融合，将多源信息得以充分的利用，使得肉的质量能够被简单，快速，准确的方法鉴定出来是今后的发展趋势和研究重点。在这里简单的介绍两种现有的识别技术。红外光

17、谱成像技术：红外光谱(Nms)是一种新型的光学检测技术，目前的使用主要集中在食品行业的检测。红外光谱技术能够完成肉品的快速、精确、无损检测，是目前分析肉和肉制品品质的关键技术。外国学者Ding用近红外光谱技术探究牛肉汉堡的掺假问题，结果显示对于掺假在5%到25%范围内的样品，判断的准确度在92.7%以上，而且掺假量越多，判断准确度越高。但是该技术的运用成本较高，耗时相对较长，一定程度上违背了本研究的初衷。牛肉汉堡的研究人员是通过采集了400 2500 nITI范围内的生、熟、切碎牛肉的光谱，对他们进行分类，然后通过修改的PLS方法建立回归模型来判断汉堡包的掺假程度，这个过程中建立模型是较困难的

18、。利用模型对其中掺入的羊肉、猪肉、脱脂奶粉和小麦粉的汉堡包的预测相关系数分别为1.00，0.99，0.89，0.78，预测标准差分别为0.57%，0.92%，2.99%，3.33%。微卫星标记技术：该技术建立了一套在微卫星标记基础上的用来鉴别牛、猪肉制品的方法。微卫星标记具有种间特异性的特点，有研究从Genbank中筛选出牛微卫星Sign和猪微卫星标记Sign，然后根据微卫星标记的侧翼序列来设计合适的引物。接着提取牛、猪肉各48个样品作为DNA模板，进行PCR扩增，经核算电泳后得到的条带长度分别为379 bp和585 bp，从目的条带是否出现来判断样品是牛肉还是猪肉。该方法进行鉴定时具有灵敏度

19、高，特异性好，而且方法简单，易于操作，结果易于判断等特点。1.4.2 PCR方法鉴定PCR扩增的特点是耗时短、准确度高，所以在最近几年的研究中成为鉴别样品类别、识别特征序列的优选手段。如：郭立宏、杜智恒等人发表的关于中国林蛙真伪品的PCR鉴别是依据GenBank发表的哺乳类SRY核酸序列和禽类EcoR I家族序列来设计出1对引物，从而对中国林蛙的真假样品进行了PCR扩增。结果表明，PCR扩增产物有明显的区别，中国林蛙、黑龙江林蛙、黑斑蛙和中华大蟾蜍分别扩增出约1000、250、450、750 bp的特征条带，说明能利用该方法精确的检测出蛙的物种。在肉样的检测上传统的都利用蛋白质技术，但由于该技

20、术对经过加工的肉制品的分析较为困难，故借鉴一系列文献，来设计出一套合理的、高效的检测肉及肉制品的PCR方法，以达到本实验的目的。1.4.3 电子鼻鉴定气味是肉类评价的过程中一个很重要的评判指标，气味是指物质挥发出的特殊风味物质刺激鼻腔后嗅觉感受器传输到大脑后形成的一种感觉。最传统的评判肉类气味是利用鼻子，这是判断气味的主要手段。但是，使用这种方法也有很多缺点，比如主观性强、重复性差，而且人的鼻子对气味具有适应性，容易出现疲劳导致影响评判的结果。在最近几年的研究中，人们开始利用一些常规的仪器，如气相色谱质谱（GC/Ms)来分析气体成份。这些设备虽然可以测定气味的组成和浓度，但是却没有办法建立它们

21、和嗅觉效果之间的关系。电子鼻就是符合上面的要求在21世纪新发展起来的一种分析、识别和检测复杂嗅味和挥发性成份的精密仪器。在已有的文献记录中，电子鼻的应用大多集中对酒类品种的鉴别、对杂粮粉种类或者产地品种的判断、对乳制品产地以及新鲜度的检测和对烟草类产品等的研究，而对肉类的研究还处于起步阶段，本实验要参考电子鼻对其他对象的方法来设计过程得到一套可行的方案。例如徐赛、周志艳等人在2014年发表了常规稻与杂交稻谷的仿生电子鼻分类识别。因为杂交稻和常规稻在食味品质等方面有一定的区别，应用电子鼻对常规稻谷与杂交稻谷气味物质识别的可行性，对同季度同地域获得的3 种杂交稻和3种常规稻稻谷样品的气味信息进行了

22、采集和分析。首先通过过载分析法分析了电子鼻检测稻谷气体挥发物时的各传感器贡献率，分别针对基于特征值的提取和稻谷气味检测对电子鼻传感器阵列中的传感器进行优化，从优化后的传感器序号可发现稻谷气体挥发物检测中应以对硫化物、氮氧化合物、芳香成分和有机硫化物敏感的传感器为主。随后，分别采用主成分分析法（principal component analysis，PCA）和线性判别法（linear discriminant analysis，LDA）对常规稻与杂交稻加以区分。1.4.4 电子舌鉴定本世纪新研制出了一种能够利用生物味来的检测物质种类的仪器叫做电子舌，该仪器最重要的部分是交互敏感传感器阵列、信号

23、调整电路以及模式识别算法。在电子舌的整个体系中，味觉物质的信号是通过传感器进行收集，并经数据分析处理获得最终结果。电子舌是一种分析、识别和检测复杂呈味物质的仪器，它能够代替感官评价员对食品的味道进行评定，而且它的检测速度快、方法简便、无有毒物质参与、无疲劳感等特点在食品检测领域中得到了广泛的应用，如食品医药、环境监测等行业。但是电子舌在肉品质量检测中应用还较少，已有的研究大多集中在肉品新鲜度检测，电子舌在肉品掺杂掺假检测研究较少。电子舌在发展过程中经历了一段较长的发展历程。近些年来，由于应用前景非常广阔，电子舌得到了巨大的发展。电子舌主要有以下两种：（1）多通道电极味觉传感器这种传感器是首个被

24、发明出来的基于非特定传感器方法的液体分析多传感器系统，即使是由1990年Toko等人研制，距离现在时间较长，但它现在仍然是最具有选择性和广泛使用的味觉传感器。这种传感器是由8个含有类脂膜的电极构成的，类脂膜是利用类脂物质组成的。类脂膜通过一种特殊手段把味觉物质的信息转换为电信号，每个类脂膜都被安装在一个带洞的塑料管上，这是为了让柱体内部就外界隔离开。而塑料管的末端用一个塞子封住，在塞子上安有Ag/Agcl电极。管子盛有3 mol/L的KC1溶液。8个检测电极被分成两组，并与2个电极夹连接。电极由机械手控制。味觉物质使类脂膜的电位发生变化，输出电信号。这个电信号是味觉物质味道的性质和强度，而不是

25、味觉物质的量的多少。由于不同的样品会产生不同的味觉特征物质造成响应模式的不同，所以，每一种味道都可以被很容易的区分开来。多通道电极味觉传感器对味觉物质的识别，实质上是基于类脂膜的。具有关文献介绍，味觉传感器系统的类脂膜具有典型的长期漂移的特征，这个长期漂移的特征依赖膜的成份和电势起伏现象。（2）伏安法电子舌一组由价格较高的金属制成的电极是伏安法电子舌的心脏部件，它取代了相对古老的方法中的单一电极。伏安法检测分为两种形式：小振幅脉冲伏安法(SAPV)和大振幅脉冲伏安法(LAPV)。电子舌在设计时运用的是LAPV，每个金属电极能在15100 mV的电压区间下运作后收集数据点。在对收集后的数据进行后

26、期处理的过程中，需要筛选最关键的数据值进行分析、识别。伏安法电子舌的特点是具有很高敏感性、鲁棒性、操作简单、功能全面等一系列优点，所以伏安法电子舌在实际的分析中得到了全面的应用。抛开这些优点这种方法还存在一些缺陷，比如在不同的金属电极上发生的化学反应间的区别还不被大家熟知，此外伏安法电子舌对细菌的敏感特性比较模糊。1.5 研究方案确定本研究同时采用了荧光定量PCR技术、电子鼻电子舌技术及近红外光谱技术，通过三种不同方法的的鉴别和对比使得结果更具有准确性。由于本实验中会研究到肉食品的种类区分，因此一般的蛋白质技术无法去辨别加工过的、蛋白质发生变性后的肉制品，而DNA片段比较耐高温、保守性强，所以

27、从分子的角度去设计实验比较合理。qPCR是耗时较短、结果准确性较高的一种分子片段长度鉴定手段，适合本实验。电子鼻和电子舌的开发是利用食品本身能够释放出的气味或味道进行收集，也就是对食品本身释放的各种不同的化学物质进行传感器检测。由于不同种类肉能释放的化学物质种类和量的不同，所以我们能利用这种手段去分析。近红外光谱技术通过对光谱信息的分析而提取出物质的特征信息，具有响应速度快、选择性和抗干扰能力强、操作成本低、适合多种状态分析及在线监测等优点，利用近红外光谱结合主成分分析法对肉类进行识别。2 实验流程和方案依据及原理说明2.1 分子生物学手段对肉类的鉴定2.1.1 基因组抽提生命物质中的DNA是

28、上携带着最重要的生物信息，它可以作为遗传信息的载体，它也是分子生命科学的主要研究对象，这一系列的研究是为了对DNA文库进行构建，对DNA进行测序并应用于杂交和基因表达。作为这些研究的前提是能够提取到高分子量和高纯度的基因组DNA，所以对于DNA的抽提是一件非常重要的操作，这也是生物实验中最基本的操作。基因组DNA提取的原理染色体是由染色丝和很多非组蛋白构成的，染色丝是一种中空的螺旋管状结构，这种结构是核小体缠绕而成的，而核小体是由DNA与组蛋白构成的。染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。想从肌肉组织中抽提该物质的DNA需要先把肌肉组织分散成单个细胞，再而通过物理手段把胞膜和核膜破碎开，使染色

29、体充分的释放出来，并把与DNA结合在一起的非组蛋白和组蛋白剔除掉。基因组提取的原则（1）保证核酸一级结构的完整性(因为遗传信息全部储存在核酸一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基层)。（2）排除其它分子(如蛋白质、多糖,、脂类、有机溶剂等)的污染，使下游试验顺利进行。2.1.2 引物设计原理（1）引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74 ，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。（2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或C

30、CC，也会使错误引发机率增加。（3）引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。（4）引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。（5）引物所对应模板位置序列的Tm值在72 左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(

31、the nearest neighbor method)。（6）G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5 kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。（8）对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。2.1.3 PCR原理聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction）（又称：多聚酶链式反应)。PCR是一种体外DNA扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性低温退火引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。变性使目的双链DNA片段在94 下解链；退火是指两种寡核苷酸引物在适当温度（50 左右）下与模板上的目的序列通过