1、天然药物化学实验 Document number【AA80KGB-AA98YT-AAT8CB-2A6UT-A18GG】天然药物化学实验实验一 天然产物化学成分系统预试验 天然产物中所含的化学成分种类很多,在深入研究之前应首先了解其中含有哪些类型的化学成分,如生物碱、皂苷、黄酮类等等。这就需要进行各类化学成分的系统定性预试验。或根据研究的需要进行单项预试法来初步判断。一、实验目的与要求 掌握未知成分的天然产物是怎样初步提取分离的,熟悉各主要成分的试管试验、沉淀反应和纸层析、薄层层析的方法并根据试验结果判断含有什么类型的化学成分。二、基本原理利用各类成分的颜色反应和沉淀反应,对天然产物的提取液进行
2、检查可以初步判断其中的化学成分。由于提取液大多数颜色较深,影响对颜色变化的观察,可以使用薄层层析(TLC)或纸层析(PC)等方法对天然产物的提取液进行初步分离,再进一步检查。三、实验内容:利用不同成分在各种溶剂中的溶解度的不同,一般可采用以下3种溶剂分别提取,试验。1水浸液:取中草药粗粉5 g加水60 ml,在5060的水浴上加热1小时,过滤,滤液进行下列试验。检查项目试 剂 名 称 糖*1、酚醛缩合反应*2、菲林试剂酚类 1% FeCl8试剂鞣质1、1% FeCl8试剂苷类或多糖*1、酚醛缩合反应*2、加6NHCl酸化,加热煮沸数分钟,冷后仔细观察有无絮状沉淀*3、菲林试剂,观察水解前后Cu
3、2O沉淀量有无增加。皂苷* 泡沫试验生物碱*1、碘化铋钾试剂*2、硅钨酸试剂 *在试管进行,在滤纸或硅胶CMC-Na薄层板上进行,下同。糖鉴定(1)-萘酚一硫酸试剂 检查还原糖。溶液I:10-萘酚乙醇溶液。溶液II:硫酸。取1ml样品的稀乙醇溶液或水溶液,加入溶液I 2滴3滴,混匀,沿试管壁缓缓加入少量溶液II,二液面交界处产生紫红色环为阳性反应。(2)斐林试剂检查还原糖。 溶液I:693g结晶硫酸铜溶于100ml水中。溶液II:346g酒石酸钾钠、10g氢氧化钠溶于100ml水中。取1ml样品热水提取液,加入4滴5滴用时配制的溶液I、II等量混合液,在沸水浴中加热数分钟,产生砖红色沉淀为阳性
4、反应。如检查多糖和苷,取1ml样品水提液,加入1m110% 盐酸溶液,在沸水浴上加热10min,过滤,(成盐去除杂质)再用10氢氧化钠溶液调至中性,按上述方法检查还原糖。或者直接用高效液相色谱看色谱图。酚类鉴定试剂(1)三氯化铁试剂 检查酚类化合物、鞣质15三氯化铁水溶液或乙醇溶液,加盐酸酸化。取1ml样品的乙醇溶液,加入试剂1滴2滴,显绿、蓝绿或暗紫色为阳性反应。作色谱显色剂用,喷洒后,显绿或兰色斑点为阳性。2乙醇提取液 取中草药粗粉5 g,加512倍量95%乙醇,在水浴上加热回流提取1小时,过滤,滤液留2 ml作(1)项试验,其余回收乙醇至无醇味,并浓缩成浸膏状,浸膏分为二部分,一部分加少
5、量2% HCL振摇溶过滤。分出酸液,作(2)项式验,附于滤纸上的一部分再以少量乙醇溶解,溶液作(3)项试验;另一部分浸膏以少量乙酸乙酯溶解,溶液置分液漏斗中加适量5% NaOH振摇,使酚性物质及有机酸等转入下层氢氧化钠水溶液中,剩下的乙酸乙酯为中性部分,用蒸馏水洗去碱性即可备用,将乙酸乙酯液23 ml,在水浴上蒸干,以12 ml乙醇溶解作(4)项试验。(1)项试验检 查 项 目酚 类鞣 质试 剂 名 称1% FeCl31% FeCl3结 果(2)项试验检 查 项 目生 物 碱试 剂 名 称*1、碘化铋钾试剂*2、硅钨酸试剂 *3、苦味酸试剂结 果(3)项试验检 查 项 目黄 酮蒽 醌试 剂 名
6、 称1、1% AlCl3试剂* 2、盐酸镁粉反应1、10% KOH液2、% Mg(Ac)2试剂结 果(4)项试验检 查 项 目香豆素与萜类内酯试 剂 名 称*1、氨基安替比林铁氰化钾呈色反应结 果3、石油醚提取液取中草药粗粉1 g,加10 ml石油醚(沸程6090),放置23小时,过滤,滤液置表面皿上任其挥发,残留物进行下列试验:检 查 项 目甾体或三萜类挥发油和油酯试 剂 名 称*1、醋酐浓硫酸试验石油醚提取液滴于滤纸片上,观察有无油斑并在加热后能否发挥结 果黄酮类鉴定试剂(1)盐酸-镁粉试剂 检查黄酮(醇)、二氢黄酮(醇)类化合物。取1ml样品的乙醇溶液,加入数毫克镁粉,滴加数滴盐酸,必要
7、时水浴上微热,显红-紫色为阳性反应。(3)三氯化铝试剂 检查具有邻二酚羟基或3-羟基、4-酮基或5-羟基、4-酮基的黄酮类化合物。1三氯化铝乙醇溶液或5三氯化铝乙醇溶液。喷洒前、后将薄层板置日光下和紫外光灯下观察,呈黄色或黄绿色荧光为阳性反应也可在滤纸上或试管中进行。(3)醋酸镁试剂 检查黄酮类,二氢黄酮类化合物,及羟基蒽醌类衍生物。 1醋酸镁甲醇溶液。在滤纸或薄层板上,点1滴样品醇溶液,挥去醇后,点1滴试剂于样品斑点边缘,加热干燥,于紫外灯下观察,黄酮类显黄色荧光,二氢黄酮类呈天蓝色荧光。显橙红色为大黄素型蒽醌,显紫色为茜草型蒽醌。生物碱鉴定试剂(1) 改良碘化铋钾试剂 为生物碱通用显色剂。
8、 溶液I:次硝酸铋溶于10ml冰醋酸,加水40ml。溶液II:8g碘化钾溶于20ml水中。溶液I和II等量混合,于棕色瓶中可以保存较长时间。目前市场上有碘化铋钾试剂可供直接配制:碘化铋钾、冰醋酸10ml加水60ml。取1m1样品的稀酸溶液加1滴2滴试剂,产生桔红色浑浊或沉淀为阳性反应。如作薄层色谱显色剂,取混合液1m1、醋酸2ml、水10ml混合即得。喷洒后呈桔红色斑点为阳性反应 (2)苦味酸试剂 为生物碱通用沉淀试剂。 苦味酸1g溶于100ml水中。取1ml样品中性溶液,加入试剂1滴2滴,产生黄色晶形沉淀。(3)硅钨酸试剂 为生物碱通用沉淀试剂。 1g硅钨酸溶于20ml水中,加10盐酸使成p
9、H2左右。取1ml样品的稀酸溶液,加入1滴2滴试剂,产生白色至褐色沉淀为阳性反应。四、药品试剂:中药饮片每组每种8克生物碱试剂(1)碘化铋钾(Dragendorff)试剂:出现桔红色或黄色沉淀。(2)苦味酸(Hager)试剂,样品液需调至中性后加试剂,出现黄色晶形沉淀。(3)硅钨酸(Bertrand)试剂:出现淡黄色或灰白色沉淀,在薄层板上应时,加热后出现黑色斑点。酚类、鞣质试剂1%三氯化铁水或乙醇试剂氨基酸、蛋白质试剂茚三酮(Ninnydrin)试剂糖、多糖和苷试剂(1)-萘酚试剂、Molish试剂(2)菲林氏反应(Fehling试剂):溶液:克结晶硫酸铜溶于1000毫升水中。溶液:349克
10、洒石酸钾钠及氢氧化钠100克,溶于1000毫升水中。皂苷试剂浓硫酸试剂黄酮类试剂盐酸镁粉反应醋酸镁反应1%三氯化铝乙醇液香豆素试剂1%三氯化铁水溶液Gibb氏反应:4-氨基安替比林-铁氰化钾(Emerson)4、玻璃仪器:(每2人或3人一组,每组一套)(1) 试管10个,滴管2个,玻棒1支(2)100ml圆底烧瓶一个,250ml圆底烧瓶一个,25cm球型或蛇型冷凝管一个,有机溶剂蒸馏回收装置1套,50ml烧杯3个,25ml具塞锥形瓶,(3)有孔白瓷板1个(4)滤纸,乳胶管、药勺仪器: (1)普通天平,(2)分析天平,(4)电水浴锅5、思考题实验学时:9学时实验二 芦丁的提取、分离及鉴定一、目的
11、要求 1以芦丁为实例学习黄酮类成分的提取分离方法。 2掌握用黄酮苷水解制取黄酮苷元的方法。 3了解黄酮类化合物的一般性质。二、基本原理槐米系豆科属植物槐树SopHora japonica. L.的花蕾,历来作为止血药,治疗痔疮、子宫出血、吐血、鼻出血,并有清肝泻火,治疗肝热目赤,头痛眩晕的功能。其主要化学成分为芸香苷(芦丁),含量高达1220,芸香苷广泛存在于植物中,现已发现含有芸香苷的植物高达70种以上,尤以槐米和乔麦中含量最高。药理实验证明芸香苷有调节毛细血管渗透作用,临床上用作毛细血管性止血药,常作为高血压症的辅助用药。槐米中主要成分的物理性质1芸香苷(芦丁, rutin):,淡黄色针状
12、结晶,mpl74178,无水物为188190。溶解度:冷水中1:8000,热水中l:200,冷乙醇中1:300,热乙醇中1:30,冷吡啶中1:12,微溶于丙酮、乙酸乙酯,不溶于苯、氯仿、石油醚等溶剂。易溶于碱液,呈黄色,酸化后又析出,可溶于硫酸和盐酸,呈棕黄色,加水稀释又析出。UV:259,299sh,359。2槲皮素(quercetin):,黄色结晶,mp313314,无水物为316。溶解度:冷乙醇中1:290,沸乙醇中1:23,可溶于甲醇、乙酸乙酯、吡啶、丙酮等溶剂,不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚。 UV:255,269sh,301sh,370。 芸香苷(芦丁, rutin) 1芸香苷分
13、子中具有酚羟基,显弱酸性,在碱水中成盐增大溶解能力,用碱水为溶剂煮沸提取,提取液加酸酸化后又成为游离的芸香苷而析出。并利用芸香苷对冷水和热水的溶解度相差悬殊的特性进行精制。 2黄酮苷可通过酸水解得到苷元和糖,并可通过薄层色谱法和纸色谱法进行检识。 3利用黄酮类化合物对紫外光有特定吸收的特征进行结构测定;也可制备乙酰化物进行结构鉴定。三、实验内容1自槐花米中提取芦丁:(1)提取方法: 称取槐花米粗粉20g(压碎),加沸水300m1,加热煮沸30min,四层纱布趁热过滤,残渣同法再操作一次,合并两次滤液,放置冰箱中析晶,待全部析出后,减压抽滤,用蒸馏水洗涤芸香苷结晶,抽干,得粗制芸香苷,置空气中干
14、燥后,称重。(2)重结晶方法:取粗芦丁2 g,加去离子水或蒸馏水400 ml,加热煮沸,趁热抽滤,放置过夜析晶(或放冷析晶),抽滤,得精制芦丁。记录:粗芦丁得率多少精制芦丁得率多少熔点2. 芦丁的水解:取芦丁1 g,加2% H2SO4 80 ml,小火加热微沸回流30分钟至1小时。开始加热10分钟为澄清溶液,逐渐析出黄色小针状结晶,即槲皮素,抽滤取结晶( 保留滤液20毫升,以检查其中所含单糖),沉淀物为芸香苷苷元(槲皮素),用蒸馏水洗至中性,抽干水分,晾干,称量。得粗制槲皮素,再用乙醇重结晶得精制槲皮素。加50%乙醇(按1克90 ml量)加热回流使槲皮素粗晶溶解,趁热抽滤,放置析晶,抽滤得精制
15、品,在减压下110干燥可得槲皮素无水物。测熔点,进行薄层层析鉴定。 取芸香苷水解后的滤液20m1,加饱和氢氧化钡溶液中和至中性(搅拌下进行),滤去白色的硫酸钡沉淀,滤液浓缩至2ml3ml或蒸于后,加2ml3 ml乙醇溶解,作为糖的供试液。3. 鉴定呈色反应 取芸香苷及槲皮素精品约10mg,各用5 ml乙醇溶解,制成样品溶液,按下列方法进行试验,比较苷元和苷的反应情况。(1)Molish反应 取样品溶液1ml,加10O% 一萘酚溶液1ml,振摇后斜置试管,沿管壁滴加 ml硫酸,静置,观察并记录液面交界处颜色变化。(2)盐酸一镁粉反应 芸香苷与槲皮素溶液分别置于两试管中,加入金属镁粉少许,盐酸2滴
16、3滴,观察并记录颜色变化。(3)醋酸镁纸片反应 取两张滤纸条,分别滴两滴芸香苷、槲皮素的乙醇溶液,然后各加1醋酸镁甲醇溶液两滴,于紫外光灯下观察荧光变化,记录现象。(4)利三氯化铝纸片反应 在两张滤纸条上分别滴加芸香苷、槲皮素醇溶液后,各加1三氯化铝乙醇溶液两滴,于紫外光灯下观察荧光变化,记录现象。(5)锆一柠檬酸反应 取样品溶液2 ml,加 2% 二氯氧锆甲醇溶液3滴4滴,观察颜色,然后加入2柠檬酸甲醇溶液3滴4滴,观察并记录颜色变化。色谱鉴定(1)芸香苷和槲皮素的薄层色谱样 品 自制芦丁、槲皮素对照品 芦丁、槲此素展开剂 (1)正丁醇-醋酸-水(415上层或411);(2)25%醋酸水溶液
17、;(3)85%醋酸水溶液显 色 (1)可见光下观察,再在紫外光下观察;(2)经氨气熏后再观察;(3)喷三氯化铝试剂后再观察 点样:提取的槲皮素及芸香苷的乙醇溶液和对照品的乙醇溶液。展开剂:正丁醇一醋酸一水(4:l:5)上层溶液。展开方式:预饱和后,上行展开。显色:喷洒三氯化铝试剂前后,置日光及紫外光灯(365nm)下检视色斑的变化。观察记录:记录图谱及斑点颜色。(2)芸香苷与槲皮素的聚酰胺色谱层析材料:聚酰胺薄膜。点样:提取的芸香苷与槲皮素的乙醇溶液和对照品的乙醇溶液。展开剂:乙醇-水(73),水饱和的正丁醇一醋酸(10:)。展开方式:上行展开。显色:喷洒三氯化铝试剂前后,置日光及紫外灯光(3
18、65nm)下检视色斑的变化。 观察记录:记录图谱及斑色颜色。(3)糖的色谱鉴定层析材料:新华层析滤纸。点样:(三)中糖的供试液及葡萄糖、鼠李糖对照品溶液。展开剂:正丁醇一醋酸一水(4:l:5)上层溶液。展开方式:上行展开。显色:氨性硝酸银试液,喷洒后先用电吹风冷吹至于,再吹热风至出现斑点为止。观察记录:记录图谱及斑点颜色。4、药品试剂药品:每组槐花米20克主要仪器及试剂仪器:(1) 烧杯(100ml ,500ml);(2) 圆底烧瓶(100ml , 150ml);(3) 冷凝管;(4) 抽滤瓶; (5) 循环水泵;(6) 紫外灯试剂:(1) %硼砂水;(2)石灰乳;(3) 乙醇, 甲醇等;(4) 2%硫酸, 盐酸;(5) ;(6) 1三氯化铝乙醇液 ;(7) 正丁醇:醋酸:水(4:1:5 或4:1:1);(8) 25%醋酸, 85% 醋酸;(9) 乙醇:水(7:3);(10)标准品: 芦丁, 槲皮素, 葡萄糖, 鼠李糖,(11)PH广泛试纸(12)聚酰胺薄膜5、思考题:1、芦丁水解不完全时将产生什么结果2、芦丁和槲皮素用不同展开剂系统展开将出现什么结果为什么3、芦丁和槲皮素聚酰胺薄层出现什么结果为什么记录:主要产物得率熔点层析示意
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