生物选修1：5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

1、专题专题5 DNA5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术课题课题2 2多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片断片断分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一其本质是在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内DNADNADNADNA分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程美美美美国国国国科科科科学学学学家家家家穆穆穆穆利利利利斯斯斯斯(K K K K.B B B B.M M M Mu u u ul l l ll l l li i i

2、is s s s)发发发发明明明明了了了了P P P PC C C CR R R R技技技技术术术术1 1 1 19 9 9 99 9 9 93 3 3 3年年年年诺诺诺诺贝贝贝贝尔尔尔尔奖奖奖奖 .DNA.DNA分子的结构分子的结构C C、H H、O O、N N、P P1.1.元素组成：元素组成：脱氧核苷酸脱氧核苷酸2.2.基本单位基本单位:一一.基础知识基础知识脱氧核脱氧核苷酸苷酸磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）OOPOHO碱基碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基533

3、5多脱氧核苷酸链结构简图多脱氧核苷酸链结构简图3.3.多脱氧核苷酸链的形成多脱氧核苷酸链的形成55334.DNA4.DNA分子的双螺旋结构分子的双螺旋结构.DNA.DNA分子是由分子是由 的（即一条的（即一条链为链为3 35 5，另一条链为，另一条链为5 53 3）脱氧）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。结构。.与与 交替连结，排列在外侧，交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；构成基本骨架；排列在链的内侧。排列在链的内侧。.两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过 连结起来，形连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定

4、与腺嘌呤一定与 配对，配对，一定一定同胞嘧啶配对。同胞嘧啶配对。双螺旋双螺旋两条反向平行两条反向平行脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基氢键氢键胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤.PCR(.PCR(多聚酶链式反应）多聚酶链式反应）2.DNA2.DNA聚合酶特性聚合酶特性不能从头合成不能从头合成DNADNA，只能从，只能从DNADNA的的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链，因此，因此，DNADNA复制需要引物。复制需要引物。3.DNA3.DNA聚合酶作用过程聚合酶作用过程当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后，DNA DNA聚聚合酶就能从合酶就能从引物的

5、引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链链，DNADNA的合成的合成方向总是从方向总是从子链的子链的55端向端向33端端延伸。延伸。1.1.1.1.定义：定义：定义：定义：是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNADNADNA片段的技术。能以极少量的片段的技术。能以极少量的片段的技术。能以极少量的片段的技术。能以极少量的DNADNADNADNA为模板，在几小时内复制出上百万份的为模板，在几小时内复制出上百万份的为模板，在几小时内复制出上百万份的为模板，在几小时内复制出上百万份的DNADNADNADNA拷贝。拷贝。拷贝。拷贝。复制从复制从3 3，端开

6、始延伸端开始延伸合成方向合成方向5 5，端向端向3 3，端端参与的组分参与的组分参与的组分参与的组分在在在在DNADNADNADNA复制中的作用复制中的作用复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶DNADNADNADNA母链母链母链母链4 4 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物（复制的起点）（复制的起点）（复制的起点）（复制的起点）胞内胞内DNADNA复制的基本体系复制的基本体系打开打开打开打开DNADNADNADNA双链双链双链双链提供提供提供提供DNADNADNADNA复制的模板复制的模板复制的模板

7、复制的模板合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成催化合成催化合成DNADNADNADNA子链子链子链子链 （形成磷酸二酯键）（形成磷酸二酯键）（形成磷酸二酯键）（形成磷酸二酯键）使使使使DNADNADNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3 3 3 3端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸PCRPCR引物是引物是人工合成的人工合成的DNADNA单链，不需解旋酶解旋单链，不需解旋酶解旋 细胞内复制和细胞内复制和PCRPCR不同点不同点?细胞内复制引物是细胞内复制引物是RNARN

8、A，需解旋酶解旋，需解旋酶解旋4.PCR4.PCR原理原理.在在8080100100C C的温度范围内，的温度范围内，DNADNA的双螺旋结的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为构将解体，双链分开，这个过程称为变性变性。.当温度缓慢降低后，当温度缓慢降低后，两条彼此分离的两条彼此分离的DNADNA链链又会重新结合成双链。又会重新结合成双链。（复性）（复性）.PCR.PCR利用了利用了DNADNA的热变性原理，通过控制温度的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCRPCR仪实仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。质上也是一台能够自动调

9、控温度的仪器。高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNADNA聚合酶失活的问题，耐高温的聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNATaq DNA聚合酶解聚合酶解决了高温导致决了高温导致DNADNA聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了PCRPCR技术的自动化。技术的自动化。5.Taq DNA5.Taq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用6.6.需要为需要为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质缓冲液缓冲液（调节酸碱度维持调节酸碱度维持PHPH不变不变）、DNADNA模板模板，分别与两条模板链相结合的分别与两条模板链相结合的两种引物两种引物，四种脱四

10、种脱氧核苷酸氧核苷酸，耐热的，耐热的DNADNA聚合酶聚合酶，同时通过，同时通过控制控制温度温度使使DNADNA复制在体外反复进行。复制在体外反复进行。ATTCCGTAAGGCCCCGGGGGGCCC3，端端5，端端3，端端5，端端TAAGGCCCCGGG引物引物引物引物5，端端5，端端3，端端3，端端7.PCR7.PCR技术的特点：技术的特点：PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出。简便、重复性好、易自动化等突出。8 8.PCR.PC

11、R的重要应用：的重要应用：广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和学、基因克隆和DNADNA序列测定等。序列测定等。.变性（模板变性（模板DNADNA解旋）解旋）模板模板DNADNA经加热至经加热至90900 0C C以上。一定时间后，使以上。一定时间后，使模板模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离，解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。应作准备。.复性（退火）复性（退火）模板模板DNADNA经加热变性成单链后，温度降到经加热变性成单

12、链后，温度降到50500 0C C左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链的互补序列配单链的互补序列配对结合。对结合。.延伸延伸(72)(72)DNADNA模板引物结合物在模板引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的成一条新的DNADNA链。链。靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循环第一步：高温变性循环第一步：高温变性靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物

13、引物引物 引物引物引物引物 5 5 5 53 3 3 35 5 5 55 5 5 53 3 3 35 5 5 53 3 3 33 3 3 3PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物引物引物引物引物5 5 5 53 3 3 35 5 5 55 5 5 53 3 3 35 5 5 53 3 3 33 3 3 3Taq DNATaq DNATaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸靶序列靶序列靶序列靶序列 靶序列靶序列靶序列靶序列第第1

14、 1个个PCRPCR循环完成后循环完成后 ：得到两个靶序列：得到两个靶序列循环循环次数次数DNADNA数量数量1 12 22 24 43 38 820201,048,5761,048,57630301,073,741,8241,073,741,8243030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量1 1、PCRPCR仪仪.设备及用具设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器。的仪器。二二.PCR.PCR的实验操作的实验操作2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量

15、转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液液体，体，其上的一次性吸液枪头其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。用一次更换一次。1.1.准备准备2.2.移液移液.实验操作步骤实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。试剂摆放在实验桌上。用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。往微量离心管里面加入各种试剂。混合后盖严微量离心管口的盖子，混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。用手指轻轻弹击管壁。3.3.混合混合过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上,离心

16、离心约约10s10s。4.4.离心离心离心目的：使反应液体集中在离心管底部，离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。提高反应效果。将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循仪的循环程序。环程序。5.5.反应反应循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸第一次第一次第一次第一次94949494，10min10min10min10min30303030次次次次94949494，30s30s30s30s55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次94949494，1min1min1min1min55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1minPCRPCR一般经历一般经历三十多次三十多次循环，每次循环可以分循环，每次循环可以分为三个基本步骤为三个基本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸.PCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的等因素的污染而造成干扰实验