教学课件：课题2.3土壤中尿素细菌的分离---分解纤维素的微生物的分离.ppt

1、尿素分子的立体结构（一）筛选菌株（一）筛选菌株水生耐热细菌Taq(Thermus aquaticus)耐高温的Taq DNA聚合酶美国微生物学科布鲁克（T.Brock)1966年发现耐热细菌选择培养基选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目统计菌落数目的理论依据：统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30300的平板进

2、行计数。说说明明设设置置重重复复组组的的重重要要性性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。（二）设置对照（二）设置对照一一是是由由于于土土样样不不同同，二二是是由由于于培培养养基基污污染染或或操操

3、作作失失误误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一一种种方方案案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另另一一种种方方案案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。一一 土壤取样土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。二二 样品的稀释样品的稀释为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量

4、和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。三三 微生物的培养与观察微生物的培养与观察 一一 无菌操作无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二二 做好标记做好标记注明培养基

5、种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三三 规划时间规划时间1、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30300的平板。在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？（一）空气中微生物总数的检测（二）水中细菌总数的检测（三）牛奶中细菌的分离与计数（四）土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数专题专题2:2:微生物的培养与应用微生物的培养与应用课题目标课题目标1 1、简述纤维素酶的种类和作用；、简述纤维素酶的种类和

6、作用；2 2、从土壤中分离出分解纤维素的微生物；、从土壤中分离出分解纤维素的微生物；3 3、讨论这类微生物的应用价值；、讨论这类微生物的应用价值；研究对象：研究对象：分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物课题重点、难点课题重点、难点 重点：重点：从土壤中分离出分解纤维素的微生物；从土壤中分离出分解纤维素的微生物；难点：难点：从土壤中分离出分解纤维素的微生物；从土壤中分离出分解纤维素的微生物；一、基础知识一、基础知识（一）纤维素与纤维素酶（一）纤维素与纤维素酶（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选（一）纤维素与纤维素酶（一）纤维素与纤维素酶:1 1、纤维素：一种由、纤维素：一种由葡萄糖葡

7、萄糖首尾相连而成的首尾相连而成的高分高分子化合物子化合物，是地球上含量最丰富的多糖。，是地球上含量最丰富的多糖。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物、木材、秸秆也富含纤维素，许多商品纤维物、木材、秸秆也富含纤维素，许多商品纤维素都是由天然纤维素制得：如水溶性的羧甲基素都是由天然纤维素制得：如水溶性的羧甲基纤维素钠（纤维素钠（a a）、不溶于水的微晶纤）、不溶于水的微晶纤维素等维素等（一）纤维素与纤维素酶（一）纤维素与纤维素酶:2 2、纤维素酶：、纤维素酶：一种复合酶，至少包括三种组分一种复合酶，至少包括三种组分一种复合酶，至少包括三种组分一种复合酶，至少包

8、括三种组分C1C1C1C1酶（外切酶）：酶（外切酶）：酶（外切酶）：酶（外切酶）：又称纤维二糖水解酶，作用于纤维又称纤维二糖水解酶，作用于纤维又称纤维二糖水解酶，作用于纤维又称纤维二糖水解酶，作用于纤维 素的结晶区或小片段纤维素，从末端切掉素的结晶区或小片段纤维素，从末端切掉素的结晶区或小片段纤维素，从末端切掉素的结晶区或小片段纤维素，从末端切掉 两个分子葡萄糖产生纤维二糖；两个分子葡萄糖产生纤维二糖；两个分子葡萄糖产生纤维二糖；两个分子葡萄糖产生纤维二糖；CxCxCxCx酶（内切酶）：酶（内切酶）：酶（内切酶）：酶（内切酶）：作用于无定型的纤维素区域，使纤作用于无定型的纤维素区域，使纤作用于

9、无定型的纤维素区域，使纤作用于无定型的纤维素区域，使纤 维素断裂成片段；维素断裂成片段；维素断裂成片段；维素断裂成片段；葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：将纤维二糖水解成葡萄糖将纤维二糖水解成葡萄糖将纤维二糖水解成葡萄糖将纤维二糖水解成葡萄糖纤维素纤维素纤维素纤维素C1C1C1C1酶、酶、酶、酶、CxCxCxCx酶酶酶酶纤维二糖纤维二糖纤维二糖纤维二糖纤维二糖纤维二糖纤维二糖纤维二糖葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖（终产物）葡萄糖（终产物）葡萄糖（终产物）葡萄糖（终产物）小实验：体会纤维素酶的作用小实验：体会纤维素酶的作用滤纸被分被分解解不加不加10ml滤纸条条2号

10、号试管管滤纸未被未被分解分解2支支试管固定在管固定在50ml的的锥形瓶中，形瓶中，140 r/min转速振速振荡反反应 1h（如无（如无摇床可以采用定床可以采用定时人工振人工振荡的方的方法）法）1ml11ml滤纸条条1号号试管管观察察记录结果果纤维素素酶酶：（70-80U）醋酸醋酸醋酸醋酸钠缓冲液：冲液：0.1mol/l滤纸条：条：1cm m6cm6cm试管管编号号小实验：体会纤维素酶的作用小实验：体会纤维素酶的作用 1U 1U表示表示1 1个酶个酶活力单位，是指活力单位，是指在在2525，其他反，其他反应条件均最适宜应条件均最适宜情况下（如情况下（如PH等）等），1min内转化内转化1mmo

11、l底物所需底物所需的酶的量。的酶的量。刚果红染色法刚果红染色法;:;:刚果红刚果红（Congo Red,Congo Red,简简称称CR)CR)染料可以与像染料可以与像纤维素这样的多糖形成纤维素这样的多糖形成红色复合物红色复合物，但，但并不和并不和水解后的水解后的纤维二糖和纤维二糖和葡萄糖葡萄糖发生这种发生这种反应反应。在含纤维素的培养基。在含纤维素的培养基中加入刚果红时便形成了红色复合物。当中加入刚果红时便形成了红色复合物。当纤纤维素被维素被纤维素分解酶纤维素分解酶分解分解后，后，刚果红刚果红 纤纤维素复合物就无法形成维素复合物就无法形成，培养基上会出现，培养基上会出现以以纤维素分解菌为中心

12、的透明圆圈纤维素分解菌为中心的透明圆圈，通过透明，通过透明圆圈来圆圈来筛选纤维素分解菌筛选纤维素分解菌。（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选二、实验设计二、实验设计土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释取样涂布：将样品取样涂布：将样品涂布到鉴别纤维素涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上分解菌的培养基上挑选产生透挑选产生透明圈的菌落明圈的菌落1 1 1 1、培养基类型：、培养基类型：、培养基类型：、培养基类型：选择培养基选择培养基选择培养基选择培养基2 2、培养基特点：、培养基特点：纤维素作为碳源纤维素作为碳源。3 3、培养基配方

13、：、培养基配方：制备培养基：制备培养基：选择培养基选择培养基纤维素粉纤维素粉5g5gNaNONaNONaNONaNO3 3 3 31g1gNaNaNaNa2 2 2 2HPOHPOHPOHPO4 4 4 47H7H7H7H2 2 2 2OOOO1.2g1.2gKHKHKHKH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 4 0.9g0.9gMgSOMgSOMgSOMgSO44447H7H7H7H2 2 2 2OOOO0.5g0.5gKClKClKClKCl0.5g0.5g酵母膏酵母膏0.5g0.5g水解酪素水解酪素0.5g0.5g上述物质溶解后加上述物质溶解后加蒸馏蒸馏水定容至水定容至1000ml

14、1000ml4 4 4 4、培养基的制备：、培养基的制备：、培养基的制备：、培养基的制备：（1 1 1 1）计算、称量：）计算、称量：）计算、称量：）计算、称量：按比例和用量准确称取按比例和用量准确称取按比例和用量准确称取按比例和用量准确称取纤维素粉纤维素粉、NaNO3NaNO3NaNO3NaNO3、Na2HPO4Na2HPO4Na2HPO4Na2HPO47H2O7H2O7H2O7H2O、KHKHKHKH2 2 2 2PO4PO4PO4PO4、KClKClKClKCl、MgSO47H2OMgSO47H2OMgSO47H2OMgSO47H2O、酵母膏、水解酪素酵母膏、水解酪素备用；备用；备用；备

15、用；（2 2 2 2）溶化：溶化：蒸馏水中加入蒸馏水中加入上述药品后上述药品后上述药品后上述药品后搅拌使溶解，完全搅拌使溶解，完全溶解后补加蒸馏水至溶解后补加蒸馏水至1000ml1000ml；调；调pHpH。（3 3）灭菌：）灭菌：将将50ml50ml培养基用玻棒转移至三角瓶中，塞培养基用玻棒转移至三角瓶中，塞上棉塞，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为上棉塞，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa100kPa、温度为温度为121121，灭菌，灭菌151530min30min。将培养皿用旧报纸包。将培养皿用旧报纸包裹（裹（5-85-8套为一包），放入干热灭菌箱内，在套为一包），放入干热灭菌箱内，

16、在160160170 170 下灭菌下灭菌2h2h。（液体培养基不用倒平板）（液体培养基不用倒平板）制备培养基：制备培养基：选择培养基选择培养基1 1 1 1、培养基类型：、培养基类型：、培养基类型：、培养基类型：鉴别培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别培养基2 2、培养基特点：、培养基特点：加入刚果红加入刚果红。3 3、培养基配方：、培养基配方：制备培养基：制备培养基：鉴别培养基鉴别培养基CMCCMCCMCCMCNaNaNaNa5-10g5-10g酵母膏酵母膏1g1gKHKHKHKH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 4 0.25g0.25g琼脂琼脂15g15g土豆汁土豆汁100ml100ml上述物质溶解后加蒸馏水定容至上述物质溶解后加蒸馏水定容至1000ml1000ml4 4 4 4、培养基的制备：、培养基的制备：、培养基的制备：、培养基的制备：（1 1 1 1）计算、称量：）计算、称量：）计算、称量：）计算、称量：按比例和用量准确称取按比例和用量准确称取按比例和用量准确称取按比例和用量准确称取酵母膏、酵母膏、CMCCMCCMCCMCNaNaNaNa、KH2PO4KH2PO4KH2