多聚酶链式反应扩增DNA片段(经典版).ppt

1、课题课题2 2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片段片段DNA指纹法在案件侦破中有重指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取场的血液、头发等样品中提取的的DNA，与犯罪嫌疑人的，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就由可能为案进行比较，就由可能为案件的侦破提供证据。件的侦破提供证据。讨论：讨论：1.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的员要怎样才能得到足够量的DNA呢？呢？2.你还能说出你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗？鉴定技术在其他

2、方面的应用吗？分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内DNADNADNADNA分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程美美美美国国国国科科科科学学学学家家家家穆穆穆穆利利利利斯斯斯斯(K K K K.B B B B.M M M Mu u u ul l l ll l l li i i is s s s)发发发发明明明明了了了了P P P PC C C CR R R R技技技技术术术术

3、1 1 1 19 9 9 99 9 9 93 3 3 3年年年年诺诺诺诺贝贝贝贝尔尔尔尔奖奖奖奖 （一）（一）DNA分子的结构分子的结构C C、H H、O O、N N、P P1.1.元素组成：元素组成：脱氧核苷酸脱氧核苷酸2.2.基本单位基本单位:一、基础知识一、基础知识脱氧核脱氧核苷酸苷酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基团上的磷酸基团上的磷酸基团上的磷酸基团上的“OHOHOHOH”和和和和另一

4、个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第另一个核苷酸分子的第3 3 3 3位碳原子位碳原子位碳原子位碳原子上的羟基上的羟基上的羟基上的羟基之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，磷酸二酯键，磷酸二酯键，磷酸二酯键，即在即在即在即在相邻的相邻的相邻的相邻的两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸两个脱氧核苷酸的的的的3 3 3 3和和和和5 5 5 5碳原子碳原子碳原子碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过之

5、间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过33，5-5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将通常将通常将通常将DNADNA的的的的羟基羟基羟基羟基“OHOHOHOH”末端称为末端称为末端称为末端称为3 3 3 3端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为5 5 5 5端端端端3.3.脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链结构简图脱氧核苷酸链结构简图DNADNA分子的平面结构分子的平面结构ATGCAG

6、CT氢氢氢氢键键键键5端端3端端5端端3端端 识别识别：-OH端为端为3;磷酸基团的磷酸基团的末端为末端为5。4.4.DNADNA分子的双螺旋结构分子的双螺旋结构.DNA.DNA分子是由分子是由 的（即一条的（即一条链为链为3 35 5，另一条链为，另一条链为5 53 3）脱氧）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。结构。.与与 交替连结，排列在外侧，交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；构成基本骨架；排列在链的内侧。排列在链的内侧。.两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过 连结起来，形连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺

7、嘌呤一定与腺嘌呤一定与 配对，配对，一定一定同胞嘧啶配对。同胞嘧啶配对。双螺旋双螺旋两条反向平行两条反向平行脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基氢键氢键胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤（1 1）DNADNA分子是由分子是由 的（即一的（即一条链为条链为3 35 5，另一条链为，另一条链为5 53 3）脱）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则氧核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。结构。4.4.DNA双螺旋结构特点：双螺旋结构特点：（2 2）与与 交替连结，排列在外交替连结，排列在外侧，构成侧，构成基本骨架基本骨架；排列在链的内侧。排列在链的内侧。（3 3）两条链上的碱基通过）两条链上的碱基通过 连结起来，连结起来，

8、形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤（即腺嘌呤（A A）一定与）一定与 配对，配对，鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）一定同）一定同 配对。配对。两条反向平行两条反向平行双螺旋双螺旋脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基氢键氢键胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）（二）（二）DNA的复制：的复制：1.1.概念：概念：由一个由一个DNADNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的DNADNA的过程。的过程。2.2.时期：时期：有丝分裂间期，减数第一次分裂前的间期。有丝分裂间期，减数第一次分裂前的间期。3.3.场所：场所：细胞核（主要）、线粒体、叶绿体

9、细胞核（主要）、线粒体、叶绿体4.4.基本条件：基本条件：酶酶:解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶能量能量:ATP:ATP原料原料:四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板模板:DNA:DNA的两条链的两条链5.5.复制特点：复制特点：a.a.边解旋边复制边解旋边复制b.b.半保留复制半保留复制6.6.遵循原则：遵循原则：碱基互补配对原则碱基互补配对原则7.7.精确复制的原因精确复制的原因a.a.规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板b.b.碱基互补配对保证了复制准确无误的进行碱基互补配对保证了复制准确无误的进行8.8.复制的意义复制的意义:DNA分子通过复

10、制将遗传信息从亲代传给了分子通过复制将遗传信息从亲代传给了后代，保持了遗传信息的连续性。后代，保持了遗传信息的连续性。参与的组分参与的组分参与的组分参与的组分在在在在DNADNADNADNA复制中的作用复制中的作用复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶DNADNA母链母链母链母链4 4 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物总结：细胞内总结：细胞内DNA复制的基本体系复制的基本体系打开打开打开打开DNADNA双链双链双链双链提供提供提供提供DNADNA复制的模板复制的模板复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原

11、料合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成催化合成催化合成DNADNA子链子链子链子链使使使使DNADNADNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的33端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸解旋酶解旋酶DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物（RNA）打开打开DNADNA双链双链模板模板合成子链的原料合成子链的原料催化子链合成催化子链合成使使DNADNA聚合酶能从聚合酶能从引物引物3 3端开始连端开始连接脱氧核苷酸接脱氧核苷酸 思考：思考：体外扩增体外扩增DNADN

12、A时，如何提供与体时，如何提供与体内内DNA复制相似条件？复制相似条件？变性变性（80100）Taq DNA聚合酶聚合酶（耐高温）（耐高温）2030个核苷酸构个核苷酸构成成DNA或或RNA二、二、PCR（多聚酶链式反应）（多聚酶链式反应）（一）（一）PCR原理原理DNA双链双链变性（加热变性（加热80-100）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）DNA单链单链变性的目的：变性的目的：解开双链解开双链复性的目的：复性的目的：有利于引物有利于引物1和引物和引物2与两条单链与两条单链的结合的结合PCR扩增仪扩增仪PCR扩增仪实际上就是一台能够扩增仪实际上就是一台能够自动调自动调控温度控温度的仪器，它可以

13、根据的仪器，它可以根据DNA的热变的热变性原理性原理，通过自动改变温度，达到扩增，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。片段的目的。1234522557294时间（时间（minmin）温度（）适温延伸适温延伸高温变性高温变性低温复性低温复性重复重复1 13 3步步3030轮轮DNA复制的方向：DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端端延伸延伸变性变性 复性复性（退火）退火）延伸延伸（二）（二）PCR的反应过程：的反应过程：二、二、PCR的反应过程的反应过程 5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物变性变性95oC复性复性55oC延伸延伸72oC5/3/3/

14、5/5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环（复制）后，模板次循环（复制）后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万（万（220）倍以上。）倍以上。三、三、PCR实验实验操作操作1 1、PCR仪仪（一）设备及用具（一）设备及用具2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5mL0.5mL3 3、微量移液器、微量移液器 用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液体液体，其其其其上的一次性吸液枪头用一次更换一次上的一次性吸液枪头

15、用一次更换一次上的一次性吸液枪头用一次更换一次上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上是能够实质上是能够自动调控温度自动调控温度的仪器的仪器4 4、离心机、离心机一种通过高速转动产生离心现象，能将一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。固体与液体分开的设备。（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备准备）（2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量离心管离心管中依次加入各组分（中依次加入各组分（移液移液）（3）盖严）盖严离心管离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合混合）（4）将微量离心管放在）将微量离心

16、管放在离心机离心机上（上（离心离心）（5）将离心管放入）将离心管放入PCR仪仪上，设置好上，设置好PCR仪的循环程序（仪的循环程序（反应反应）循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸延伸第一次第一次第一次第一次9494，5min5min30303030次次次次9494，30s30s5555，30s30s7272，1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次44，1min1min5555，30s30s7272，1min1min（二）操作步骤：（二）操作步骤：四、四、结果分析与评价结果分析与评价DNA 含量的测定含量的测定：稀释稀释 对照调零对照调零 测定测定 计算计算5050倍倍蒸馏水做蒸馏水做对照对照波长波长260nm处读数处读数（一）理论上（一）理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算四、四、课题成果评价课题成果评价1 1、一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2 n n2 2、a a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为a x2 a x2 n n（二）实验中（二）实验中DNADNA含量的测定含量的