基因工程及其应用(公开课).ppt

1、基因工程及基因工程及其应用其应用第第2节节能产生人胰岛素的大肠杆菌一、基因工程一、基因工程(gene engineering)(gene engineering)又叫做又叫做基因拼接技术基因拼接技术或或DNADNA重组技术重组技术。通俗的。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，另一种生物的细胞里，定向定向地改造生物的地改造生物的遗遗传性状传性状。原理原理操作环境操作环境操作水平操作水平结果结果基因重组基因重组生物体外生物体外DNA分子水平分子水平定向地改造

2、生物的遗传性状，定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。获得人类所需要的品种。培育转基因大肠杆菌的简要过程：培育转基因大肠杆菌的简要过程：你认为上述培育转你认为上述培育转你认为上述培育转你认为上述培育转基因大肠杆菌的关基因大肠杆菌的关基因大肠杆菌的关基因大肠杆菌的关键步骤有哪些？键步骤有哪些？键步骤有哪些？键步骤有哪些？普通大肠杆菌普通大肠杆菌(不能分泌胰岛素不能分泌胰岛素)人体组织细胞人体组织细胞提取提取提取提取胰岛素基因胰岛素基因与运载体与运载体与运载体与运载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入大肠杆菌大肠杆菌(含含胰岛素基因胰岛素基因)转基因大肠杆菌转基因大肠杆菌(能分

3、泌胰岛素能分泌胰岛素)1.ONE1.ONE胰岛素基胰岛素基因从人体因从人体细胞内提细胞内提取出来取出来2.TWO2.TWO胰岛素基胰岛素基因与运载因与运载体体DNADNA连连接接3.THREE3.THREE胰岛素基因胰岛素基因导入受体导入受体(大肠杆菌大肠杆菌)细胞细胞基因的基因的“剪刀剪刀”基因的基因的“针线针线”基因的运载体基因的运载体培育转基因大肠杆菌的关键步骤：培育转基因大肠杆菌的关键步骤：1、基因的基因的“剪刀剪刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 二、基因操作的工具二、基因操作的工具能能被同一种限制酶切断的不同的被同一种限制酶切断的不同的DNADNA分分子是否具有相同的黏性末端？子

4、是否具有相同的黏性末端？思考思考:2、基因的、基因的“针线针线”DNA连接酶连接酶连接酶的作用：连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的之成为一个完整的DNA分子。分子。连接的部位：连接的部位：生成磷酸二酯键生成磷酸二酯键DNA连接酶的作用过程：连接酶的作用过程：连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的端连接起来，使之成为一个完整的DNADNA分子。分子。基因的针线：基因的针线：DNA连接酶连接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T

5、 T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同种限制酶切割3、基因的运输工具、基因的运输工具运载体运载体 常常用用的的运运载载体体：质质粒粒、噬噬菌菌体体和和动植物病毒等动植物病毒等标记基标记基因，便因，便于进行于进行检测。检测。质粒存在于质粒存在于许多细菌和酵母许多细菌和酵母菌等生物中菌等生物中,是细是细胞染色体外能够胞染色体外能够自主复制的很小自主复制的很小的环状的环状DNADNA分子分子.作为运载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以

6、便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。1、细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子；2、质粒的存在对宿主细胞无影响；3、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒可作为有何特点？三、基因工程的操作步骤三、基因工程的操作步骤从细胞中分从细胞中分离出离出DNA从大肠杆菌从大肠杆菌中提取质粒中提取质粒限制限制 酶酶提取目的基因提取目的基因限制酶限制酶目的基因与运目的基因与运载体结合载体结合DNA连连 接酶接酶目的基因导入目的基因导入受体细胞受体细胞目的基因的表目的基因的表达与检测达与检测基因工程操作的基本步骤基因工程操作的

7、基本步骤四个四个基本步骤：基本步骤：1）提取提取目的基因目的基因2）目的基因）目的基因与与运载体结合运载体结合3）将目的基因）将目的基因导入导入受体细胞受体细胞4）目的基因的）目的基因的检测检测和和表达表达三、基因工程的操作步骤三、基因工程的操作步骤目的基因的提取方法目的基因的提取方法直接分离基因直接分离基因人工合成基因人工合成基因反转录法反转录法根据已知的氨基酸序列根据已知的氨基酸序列合成合成DNA：鸟枪法鸟枪法二、基因工程的操作步骤二、基因工程的操作步骤用限制用限制酶切断成酶切断成许多片段许多片段直接分离基因直接分离基因鸟枪法鸟枪法将供体细胞中的将供体细胞中的DNADNA用限制用限制酶切割

8、为许多片段，再用运载体酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到不同的受体将这些片段都运载到不同的受体细胞中去，让这些细胞中去，让这些DNADNA片段在受片段在受体细胞中扩增。从中找出含有目体细胞中扩增。从中找出含有目的基因细胞，并将含有目的基因的基因细胞，并将含有目的基因的的DNA片段片段分离出来。分离出来。该法最大的缺点是带有很大该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大。一般不适的盲目性，工作量大。一般不适用于真核细胞的基因。用于真核细胞的基因。人工合成基因法人工合成基因法DNADNA合成仪合成仪直接合成法：根直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使推算出信使

9、RNARNA核苷酸核苷酸顺序，再据此推算出基顺序，再据此推算出基因因DNADNA的脱氧核苷酸顺的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。直接合成相应的基因。反转录法：以信使反转录法：以信使RNARNA为模板，在逆转录酶为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(DNA(基因基因)。用与提取目的基因相同用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连拉

10、酶的作用补配对后，在连拉酶的作用下连接形成重组下连接形成重组DNADNA分子。分子。目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合三、基因工程的操作步骤三、基因工程的操作步骤 目的基因与运载体结目的基因与运载体结合的结果可能有三种情合的结果可能有三种情况：目的基因与目的基况：目的基因与目的基因结合，质粒与质粒结因结合，质粒与质粒结合，目的基因与质粒结合，目的基因与质粒结合。所以需要筛选。合。所以需要筛选。作用：将外源基因送入作用：将外源基因送入受体细胞受体细胞常用的受体细胞：常用的受体细胞：常用的受体细胞：常用的受体细胞：步骤三：目的基因导入受体细胞步骤三：目的基因导入受体细胞 有大肠杆菌、枯草杆菌

11、、土壤农杆菌、酵母有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。菌和动植物细胞等。菌和动植物细胞等。菌和动植物细胞等。主要借鉴细菌或病毒侵然细胞的途径主要借鉴细菌或病毒侵然细胞的途径导入方式：导入方式：三、基因工程的操作步骤三、基因工程的操作步骤 1）将细菌用）将细菌用）将细菌用）将细菌用CaClCaCl2 2处理处理处理处理，以，以，以，以增大增大增大增大细菌细菌细菌细菌细胞壁的细胞壁的细胞壁的细胞壁的通透性通透性通透性通透性。2 2）使含有目的基因的）使含有目的基因的）使含有目的基因的）使含有目的基因的重

12、组质粒进入重组质粒进入重组质粒进入重组质粒进入受体细胞。受体细胞。受体细胞。受体细胞。3 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制复制复制复制，由于细菌由于细菌由于细菌由于细菌繁殖的速度繁殖的速度繁殖的速度繁殖的速度非常快，在很短的时间内就非常快，在很短的时间内就非常快，在很短的时间内就非常快，在很短的时间内就能获得能获得能获得能获得大量大量的目的基因。的目的基因。的目的基因。的目的基因。三、基因工程的操作步骤三、基因工程的操作步骤导入过程：运载体为质粒，受体细胞为细菌导入过程：运载体为质粒，

13、受体细胞为细菌大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。检测出来。将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物三、基因工程的操作步骤三、基因工程的操作步骤步骤四：目的基因的

14、检测和表达步骤四：目的基因的检测和表达检测：通：通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否基因的有无，来判断目的基因是否导入。入。表达：通表达：通过特定性状的特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。生与否来确定目的基因是否表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因分子后就说明目的基因完成了表达吗？完成了表达吗？步骤四：目的基因的检测和表达步骤四：目的基因的检测和表达三、基因工程的操作步骤三、基因工程的操作步骤二、基因工程的操作步骤二、基因工程的操作步骤水母 转基因抗虫棉花转基因抗虫棉花转入苏云金杆菌转入苏云金杆菌的一个抗虫基因，的一个抗虫基因，是中国目前最主要是中国目前最主要的

15、转基因作物的转基因作物 1、基因工程与作物育种转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基转鱼抗寒基因的番茄因的番茄转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯不会引起过敏的转基因大豆不会引起过敏的转基因大豆运用基因工程技术，不但可以培养优质、运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。以培养出具有特殊用途的动、植物。乳汁中含有人生长激素的转乳汁中含有人生长激素的转基因牛基因牛(阿根廷阿根廷)生长快、耐不良环境、肉质生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼好的转基因鱼(中国

16、中国)导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠导入人基因具特殊用途的猪和小鼠导入人基因具特殊用途的猪和小鼠超级超级动物动物特殊特殊动物动物我国生产的部分基因我国生产的部分基因工程疫苗和药物工程疫苗和药物 基因工程药品的生产基因工程药品的生产许多药品的生产是许多药品的生产是从生物组织中提取的。从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂限，其价格往往十分昂贵。贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。量问题，还能大大降低生产成本。2、基因工程在医学上的应用胰岛素从猪、牛等动物的胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，胰腺中提取，100Kg100Kg胰腺只能胰腺只能提取提取4-5g4-5g的胰岛素，其产量之的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基将