完整版谷氨酸发酵.docx

1、完整版谷氨酸发酵1）生物素营养缺陷型作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外泄漏.控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10g/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换.2）油酸营养缺陷型作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右.控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换

2、. （3）添加表面活性剂添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨酸.机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜.关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下进行分裂,形成产酸型细胞.（4）添加青霉素机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸.控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换. 谷氨酸发酵强制控制工艺为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易

3、控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取“强制控制”的方法,如:“高生物素 高吐温”或“高生物素 高青霉素”的方法.控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料中生物素含量变化的影响,高生物素、大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产。谷氨酸发酵1.适应期:尿素分解出氨使pH上升.糖不利用.2-4h.措施:接种量和发酵条件控制使适应期缩短.2.对数生长期:糖耗快,尿素大量分解使pH上升,氨被利用pH又迅速下降.溶氧急剧下降后维持在一定水平.菌体浓度迅速增大,菌体形态为排列整齐的八字形.不产酸.

4、12h.措施:及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH,在pH7.5-8.0时流加尿素;维持温度30- 323.菌体生长停止期:谷氨酸合成.措施:提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4.大量通*,控制温度34-37 .4.发酵后期:菌体衰老,糖耗慢,残糖低.措施:营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐.发酵周期一般为30h.二、谷氨酸发酵的生化过程（1）是代谢控制发酵的典型代表（2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的整个过程可简单的分为2 个阶段: 第1阶段是菌体生长阶段;第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量积累。 三、合成谷氨酸的生化途径（一）、GA 的生物合成途径主要有：Glucose的酵

5、解，EMP Glucose的有氧氧化，HMP 丙酮酸的有氧氧化，TCA循环 乙醛酸循环途径，DCA循环 CO2固定反应 -酮戊二酸（ -KGA）的还原氨基化 这6条途径之间是相互联系和相互制约的，如图所示：（二）、GA生物合成的内在因素从上图可以看出，菌体要在葡萄糖含量10%以上的培养基上，合成5%以上的谷氨酸，是一种不正常的现象，显然GA产生菌必须具备以下条件：谷氨酸生产菌的生化特征内在因素 1 生物素缺陷型谷氨酸产生菌大多数为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时,通过控制生物素亚适量(贫乏量) ,引起菌种代谢失调, 使谷氨酸得到大量积累。2 具有CO2 固定反应的酶系菌种能利用CO2 产生大量草酰乙

6、酸, 有利于谷氨酸的大量积累。3.-KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失这是菌体生成并积累-KGA的关键，从上图可以看出，-KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在-KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由-KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内-KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，-KGA才得以积累，为谷氨酸的生成奠定物质基础。4. GA产生菌体内的NADPH氧化能力欠缺或丧失1）如上图所示，NADPH是-KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联 的。（2）由于NADP

7、H的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制-KGA的脱羧氧化有一定的意义。5. 产生菌体内乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA发酵的首要条件。糖的代谢才能沿着- 酮戊二酸的方向进行, 从而有利于谷氨酸的积累。6.菌体有强烈的L-谷氨酸脱氢酶活性-KGA + NH4+ +NADPH = GA + NADP (NADH :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADPH :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸) L-谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内

8、该酶的酶活性都很强， - 酮戊二酸易生成谷氨酸。该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联，反应机制如下：偶联反应 -KGA NADPH -KGA GA NADP 异柠檬酸CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。提高GA的潜力1）强化CO2固定反应，具体措施：Mn+ ，生物素.（2）控制溶氧浓度是非常重要的低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化高的溶氧浓度，则NADPH 有被氧化的可能，（五）GA发酵的外在因素GA发酵是一个典型的代谢控制发酵，固然有其内在的菌体特性。但是正如任何事物发展的基本规律一样，外在因素仍然有重要的作用，对于GA的发酵也是一样。1.供氧浓度过量：NADPH的再氧化能力

9、会加强，使-KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA 的生成。供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。2. NH4+浓度（1）影响到发酵液的pH值（2）与产物的形成有关：NH4+过量，菌体增殖阶段会抑制菌体生长，产酸阶段Glu会受谷氨酰胺合成酶作用转化为谷氨酰胺（ Gln）NH4+不足，不利于-KGA的还原氨基化， -酮戊二酸积累，引起反馈调节NH4+与产物的形成3.磷酸盐过量：（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等 （2）产生并积累缬氨酸（ Val）环境条件 4.

10、发酵液的碳氮比发酵液中糖含量与谷氨酸的发酵有密切的关系。在一定范围内, 谷氨酸的产量随糖含量的增加而增加, 但糖含量过高, 渗透压过大, 对菌体生长不利, 谷氨酸对糖的转化率低。发酵液中还原糖的含量一般应控制在10 %13 % 。环境条件 氮源是合成菌体细胞蛋白质、核酸和谷氨酸的氨基来源，大约85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌体。谷氨酸发酵需要的氮源比一般发酵工业多得多，一般发酵工业碳氮比为100：0.2-2.0，谷氨酸发酵的碳氮比为100：15-21。在谷氨酸发酵过程中,应正确控制碳氮比。一般在菌体生长期碳氮比应大一些(氮低）,在产酸期,碳氮比应小些(氮高） 。在碳源和氮源的

11、比为31时，谷氨酸棒状杆菌会大量合成谷氨酸，但当碳源和氮源的比为41时，谷氨酸棒状杆菌只生长而不合成谷氨酸。环境条件 5. 生物素谷氨酸产生菌是营养缺陷型, 对生长繁殖、代谢产物的影响非常明显。当生物素过量时酵解途径中的丙酮酸转变为乳酸, 同时也使异柠檬酸转变为琥珀酸,菌体生长繁殖快,同时生物素又促进菌体细胞膜通透性障碍物的生物合成, 使菌体不能及时将细胞内的谷氨酸排出,谷氨酸合成途径受阻,发酵液中由菌种细胞排出的谷氨酸仅能占氨基酸总量的12%;生物素亚适量时,菌体代谢失调,细胞膜通透性增强,细胞内的谷氨酸能及时排出,有利于谷氨酸的积累, 发酵液内由菌体细胞排除谷氨酸能达总氨基酸的92%左右。

12、因此,要根据发酵时期来控制生物素的含量。环境条件 6. 发酵温度谷氨酸发酵前期应采取菌体生长最适温度,即3032 。温度过低, 菌体生长繁殖慢;若温度过高,菌体易衰老, 生产中表现为DO 值增长慢, 耗糖慢, pH值高, 最终发酵周期长,产酸少。发酵中、后期菌体生长基本停止, 为积累大量谷氨酸, 应适当提高发酵温度,但温度过高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。环境条件 7. pH值1） pH值对谷氨酸产生菌生长的影响谷氨酸产生菌象其它微生物一样, 有最适生长pH值范围, 当高于或低于这个值时:(1) 菌体内的酶受到抑制, 菌体新陈代谢受阻, 生长停滞; (2) 菌体细胞膜所带电荷发生改变, 从而改变

13、细胞膜的渗透性, 影响菌体对营养的吸收和代谢产物的排出; (3) 影响培养基组分和中间代谢产物的离解, 从而影响菌体对这些物质的利用。环境条件 2） pH值对谷氨酸积累的影响谷氨酸脱氢酶是合成谷氨酸的主要酶,它的最适pH为7.07.2 ,当发酵液的pH值偏酸时(pH 5.0-5.8) ,谷氨酸脱氢酶受到抑制,代谢向着生成谷氨酰胺和乙酰谷氨酰胺的方向进行。在发酵后期由于耗用大量NH4+ ,pH值下降, 此时就要进行pH值调节,以保证发酵的正常进行。环境条件 pH发生变化的主要原因是培养基中营养成分的利用和代谢产物的积累。如当谷氨酸棒状杆菌利用糖类物质不断生成谷氨酸时，培养液的pH就会下降。而碱性

14、物质的消耗和氨的生成等则会导致培养液的pH上升。pH：前期pH（7.5-8.0），中后期pH7.0-7.6。通过采用流加尿素，氨水或液氨等办法调节pH，补充氮源。 环境条件 8. 通风 （同1.供氧浓度）通风的实质就是供氧并使菌体和培养基充分混合。谷氨酸产生菌为兼性好氧菌, 在有氧、无氧的条件下都能生长,只是其代谢产物不同。在谷氨酸发酵过程中,通风必须适度。风量过大,氧气充足,在长菌阶段表现为耗糖慢, 菌体生长慢, pH值偏高, 产酸阶段, 供氢体被氧化,谷氨酸合成受阻,积累 - 酮戊二酸; 风量小, 供氧不足, 长菌阶段表现为菌体生长快,在产酸阶段,葡萄糖进入菌体后, 进行不完全氧化,产物由

15、谷氨酸变为乳酸。环境条件 9. 泡沫 谷氨酸发酵是好气性发酵, 因通风和搅拌产生泡沫是正常的, 但泡沫过多会带来一系列问题: (1) 泡沫形成泡盖时, 代谢产生的气体不能及时排出,妨碍菌体呼吸作用,影响菌体的正常代谢; (2) 泡沫过多, 发酵液会外溢,造成浪费和污染; (3) 泡沫过多,易冲上罐顶,造成染菌。因此,在谷氨酸的发酵过程中控制好过多的泡沫是发酵成败的关键。 谷氨酸产生菌的发酵条件与产物的关系谷氨酸发酵过程中,生产菌种的特性、生长素、发酵温度、pH值、通风和发酵产生的泡沫都是影响谷氨酸积累的主要因素。在实际生产中,只有针对存在的问题,严格控制工艺条件,才能达到稳产、高产的目的。 假

16、设人们想利用葡萄糖、谷氨酸棒状杆菌生产-酮戊二酸，请你利用现有知识，如何设计一个大量积累-酮戊二酸的方案? 菌种：对谷氨酸捧状杆菌进行诱变处理，选育不能合成谷氨酸脱氢酶的菌种条件：氧（通风）、NH4+、C/N；pH、磷酸盐、温度、生物素、 Mn+代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用(一)遗传学方法 2 抗反馈控制突变株的应用 3 选育组成型突变株和超产突变株（二）生物化学方法（三）控制细胞膜渗透性（三）控制细胞膜渗透性四、谷氨酸发酵 1）谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、黄色短杆菌。我国使用的生产菌株是北京棒杆菌AS1.299、北京棒杆菌D110、钝齿棒杆菌AS1.542、棒杆菌S-9

17、14和黄色短杆菌T6-13等。 生产菌株特点 在己报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有一些共同特点:革兰氏阳性菌体为球形、短杆至棒状不形成芽孢没有鞭毛，不能运动需要生物素作为生长因子在通气条件下才能产生谷氨酸。2）生产原料发酵生产谷氨酸的原料有淀粉质原料：玉米、小麦、甘薯、大米等。其中甘薯和淀粉最为常用；大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行液化，85 30min，加糖化酶60 糖化24h，过滤后可供配制培养基。糖蜜原料：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜；糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。预处理方法：活性碳或树

18、脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加中青霉素。 氮源料：尿素或氨水。3）工艺流程 味精生产全过程可分五个部分：原料的预处理及淀粉水解糖的制取；谷氨酸生产菌种子的扩大培养；谷氨酸发酵；谷氨酸的提取与分离；由谷氨酸制成味精及味精成品加工 。 味精生产的主要原材料为淀粉辅助材料包括硫酸、液氨、碳酸钠、活性碳、液碱、盐、消泡剂、淀粉酶等年产12万吨味精，主要原辅材料耗用如下表：项目单位：吨淀粉196,870液氨 31,108硫酸 35,000碳酸钠 30,000活性碳 2,500液碱 40,000盐 8,000消泡剂 77,960淀粉酶 11,6944）发酵

19、生产工艺 培养基成分碳源：碳源是构成菌体和合成谷氨酸的碳架及能量的来源。谷氨酸产生菌是异养微生物，只能从有机物中获得碳素，细胞进行合成反应所需要能量也是从氧化分解有机物过程中得到的。实际生产中以糖质原料为主。培养基中糖浓度对谷氨酸发酵有密切的关系。在一定的范围内，谷氨酸产量随糖浓度的增加而增加。 氮源：氮源是合成菌体蛋白质、核酸及谷氨酸的原料。碳氮比对谷氨酸发酵有很大影响。大约85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌体。谷氨酸发酵需要的氮源比一般发酵工业多得多，一般发酵工业碳氮比为100：0.2-2.0，谷氨酸发酵的碳氮比为100：15-21。 无机盐：是微生物维持生命活动不可缺少的

20、物质。主要功能：构成细胞的组成成分；作为酶的组成成分；激活或抑制酶的活力；调节培养基的渗透压；调节培养基的pH；调节培养基的氧化还原电位。起着调节微生物生命活动的作用。发酵时，使用的无机离子有K+、Mg2+、Fe2+、Mn2+等阳离子和PO43-、SO42-、Cl等阴离子，其用量如下： 生物素：凡是微生物生命活动不可缺少，而微生物自身又不能合成的微量有机物质都称为生长因子。生长因子通常是指氨基酸、嘌呤、嘧啶和B族维生素的一种，生物素又叫维生素H或辅酶R。糖质为碳源的谷氨酸产生菌几乎都是生物素缺陷型，这些细菌本身都不能合成生物素。生物素的作用是影响代谢途径；影响细胞的渗透性。生长因子含量的多少，

21、与生产有着十分密切的关系。实际生产中通过添加玉米浆、麸皮水解液、糖蜜等作为生长因子的来源，来满足谷氨酸产生菌必须的生长因子。 培养基 a斜面培养基葡萄糖0.1%、牛肉膏1.0%、蛋白胨1.0%、氯化钠0.5%、琼脂2.0%、pH7.07.2121灭菌30min32培养18-24h(传代和保藏斜面不加葡萄糖)。 b 一级种子、二级种子及发酵培养基一级种子葡萄糖2.5%、尿素0.6%、KH2PO40.1%、MgSO4.7H2O0.04%、玉米浆2.3-3.0ml、pH7.0, 1000ml装200-250ml振荡，32 培养12h。二级种子水解糖3.0%、尿素0.6%、玉米浆0.5-0.6ml、K

22、2HPO40.1-0.2%、MgSO4.7H2O0.04%、pH7.0,呈单个或八字排列。活菌数为108-109 /ml。发酵培养基水解糖12-14%、尿素0.5-0.8%、玉米浆0.6ml、MgSO4.7H2O0.06%、KCl0.05%、Na2HPO40.17%、pH7.0 发酵条件的控制 a温度谷氨酸发酵前期(0-12h)是菌体大量繁殖阶段，在此阶段菌体利用培养基中的营养物质来合成核酸、蛋白质等，供菌体繁殖用，而控制这些合成反应的最适温度均在3032。对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八

23、字形。不产酸。12h。措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，在pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度30- 32在发酵中、后期，是谷氨酸大量积累的阶段，而催化谷氨酸合成的谷氨酸脱氢酶的最适温度在3236，故发酵中、后期适当提高罐温对积累谷氨酸有利。 bpH值发酵液的pH影响微生物的生长和代谢途径。发酵前期如果pH偏低，则菌体生长旺盛，长菌而不产酸；如果pH偏高，则菌体生长缓慢，发酵时间拉长。在发酵前期将pH值控制在7.5-8.0左右较为合适，而在发酵中、后期将pH值控制在7.0-7.6左右对提高谷氨酸产量有利。 c 通风在谷氨酸发酵过程中，发酵前期以低通风量为宜；发酵中、后期以高通风量为

24、宜。实际生产上，以气体转子流量计来检查通气量，即以每分钟单位体积的通气量表示通风强度。另外发酵罐大小不同，所需搅拌转速与通风量也不同。 d泡沫的控制在发酵过程中由于强烈的通风和菌体代谢产生的CO2，使培养液产生大量的泡沫，不仅使氧在发酵液中的扩散受阻，影响菌体的呼吸和代谢。给发酵带来危害，必须加以消泡。消泡方法有机械消泡(耙式、离心式、刮板式、蝶式消泡器)和化学消泡(天然油脂、聚酯类、醇类、硅酮等化学消泡剂)两种方法。 e发酵时间不同的谷氨酸产生菌对糖的浓度要求也不一样，其发酵时间也有所差异。低糖(10%-12%)发酵，其发酵时间为36-38h，中糖(14%)发酵，其发酵时间为45h。 谷氨酸

25、发酵例子某谷氨酸发酵，发酵过程中各种参数的变化情况如图所示。最后的发酵液中谷氨酸的浓度很低，发酵周期较长，而这段时间却有大量的葡萄糖被消耗，那么，这些被消耗的葡萄糖到哪里去了？如以上两种情况都不是，发酵过程中出现了这种异常情况，还有什么原因呢？须根据发酵过程中其他参数如溶氧浓度的变化，结合菌体形态观察等进一步分析，是由于发酵用培养基中添加的玉米浆过量，导致生物素浓度过高，这样菌体不能顺利地实现从生长型到产物积累型的转变，因而出现了这种在工业生产上称之为“只长菌，不产酸”的发酵异常现象。五、谷氨酸提取工艺等电点法提取操作简单，收率60。周期长，占地面积大等电点法提取谷氨酸原理谷氨酸：-型斜方晶体

26、（好），-型鳞片状晶体；型结晶水分在510%,而型结晶水分则高达1520%。生产上应防止型晶体的生成。 注意三个方面A、发酵液纯度高：谷氨酸/残糖比值高，胶体少，提前除菌体最好；B、发酵液处理要及时；C、加酸调pH、温度、育晶时间、搅拌服从结晶规律。等电点法提取谷氨酸原理谷氨酸在等电点时,绝大部分以偶极离子(GA)状态存在,其分子内部正负电荷相等,并含有等量的带不同电荷的阳离子(GA+)和阴离子(GA-),因此溶液中总静电荷等于零。由于谷氨酸分子之间相互碰撞,再通过静电引力的作用,结合成较大的聚合体而被沉淀析出,因而处于等电点时GA的溶解度最小。又由于温度对GA的溶解度影响很大,温度越低溶解度

27、越小,生产上多采用04。这就是工业粗提味精所用的等电点法提取谷氨酸原理 等电点法提取谷氨酸原理等电点时谷氨酸四种离子方式在水溶液中所占的比例GA+: 7.861%, GA: 84.24%, GA-: 7.861%, GA=: 0.278910-5% 离子交换法提取GA的原理离子交换法提取GA的原理当氨基酸pH值大于3.22时羧基离解而带负电,它能被阴离子交换树脂吸附;当pH小于3.22时氨基离解而带正电,此时能被阳离子交换树脂吸附。离子交换法提取GA是利用阳离子交换树脂对GA阳离子的选择性吸附,以使发酵液中阻碍GA结晶的残糖及糖的聚合物、蛋白质、色素等非离子性杂质得以分离,然后经洗脱达到浓缩提

28、取GA的目的。 离子交换法提取发酵液稀释并调pH5.0-5.5?上柱732#阳离子(H型)交换70水洗*（正或反洗） 604%NaOH液正洗脱高流分收集调pH3.2结晶离心分离谷氨酸树脂：苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂732#、730#和甲基丙烯酸弱酸型阳离子交换树脂。树脂处理：柱水洗（正和反洗）5.4% HCl再生水洗水洗*:洗脱粘附于树脂表面的菌体、胶体,并疏松树脂料液中不仅有GA，还有NH4+和其他金属离子;阳离子交换树脂对NH4+和其他金属离子的亲和力大于对谷氨酸的亲和力 。上柱时NH4+和其他金属离子先发生交换，把H+置换下来，液体pH降低，使主要以GA+形式存在，随后GA+发生交换。水洗*目的:温柱，防止GA在柱中结晶析出产生“结柱”预热树脂，避免热碱液聚热发生破碎采用NaOH洗脱剂洗脱时,由于谷氨酸在树脂内部较为集中,NaOH浓度不能太高,温度又不能太低。一般以4%的浓度,6070的温度洗脱较好,否则将产生“结柱”。离子交换收集液的低（初）流分可以上柱再交换；高流分收集调pH3.2结晶；后流分单独上离子交换柱进行回收。 谷氨酸解离常数和等电点以GA+、GA、GA-、GA=等四种离子方式存在 离子交换法提取谷氮酸是以其两性解离为基础在酸性条件下(pH0.34g/100ml）当温度低于相转变温度时,相稳定,相不稳定,过饱和溶液将主要析出晶体。当温度低于某个限度,过饱和溶