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1、Transwell实验 超详细Transwell侵袭实验总结之袁州冬雪创作第一节 概念这里想明白两个概念，一个是Transwell，另外一个是肿瘤细胞侵袭模子.关于Transwell这个词该如何诠释，查了很多资料也未见准确的注解，我感觉可以这么懂得吧，trans这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上懂得，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的先容，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）.更准确地说，Transwell应该是一种实验技

2、术，这项技术的主要资料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，分歧厂家对Transwell会有分歧的定名，而分歧型号也可有分歧形状，分歧大小，根据实验需要，可有分歧选择.但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的资料与普通的孔板是一样.这层膜带有微孔，孔径大小有0.112.0m，根据分歧需要可用分歧资料，一般常常使用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）.下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中

3、，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔.我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响.应用分歧孔径和颠末分歧处理的聚碳酸酯膜，便可以停止共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究.下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子详细来谈谈孔径的选择，当然分歧细胞其体积分歧，详细选择时要思索到细胞大小.这里主要谈几种大家常常使用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及

4、细胞运动才能，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0m以下孔径.常常使用0.4、3.0m.我们实验室用的是0.4m.将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢发生的物质对细胞A的影响.（2）趋化性实验可用5.0、8.0、12.0m膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化才能.细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢发生的物质对细胞A的趋化作用.趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用.（3）肿瘤细胞迁移实验常常使用8.0、12.0

5、m膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移才能.（4）肿瘤细胞侵袭实验常常使用8.0、12.0m膜，原理与肿瘤细胞迁移实验近似.上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验分歧的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以仿照体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜.计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭才能.用于研究肿瘤细胞侵袭才能的肿瘤细胞侵袭模子有如下几种（引自司徒镇强细胞培养）：2.1

6、 体内癌细胞侵袭模子2.1.1 皮下移植侵袭模子2.1.2 肌肉内移植侵袭模子2.1.3 腹腔内移植侵袭模子2.1.4 小鼠肾包膜下移植侵袭模子2.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模子2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模子2.1.7 鼠爪垫皮下移植侵袭模子2.1.8 视网内界膜侵袭模子2.2 体外癌细胞侵袭模子2.2.1 体外运动器官培养法2.2.1.1 半固体培养基单细胞器官培养法2.2.1.2 液体培养基单细胞器官培养法2.2.2 半体外半体内器官培养法2.2.3 单层细胞器官培养法2.2.4 瘤细胞球体器官培养法2.2.4.1 运动球体器官培养法2.2.4.2 旋转摇动球体器官培养法2.2.5

7、 单层细胞侵袭实验模子2.2.6 Transwell侵袭小室测定法可见，Transwell与侵袭实验之间其实不克不及划等号，Transwell有多种应用，侵袭实验也有多种方法.所谓Transwell侵袭实验，其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验.由于其简单易行、重复性好，因而得到了越来越广泛的应用，但不克不及认为研究肿瘤侵袭只有Transwell一种方法.第二节 Transwell侵袭实验我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验.1.实验用品： Tr

8、answell小室：多种厂家可提供，论坛里常常使用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，还有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友先容的Thincert.这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来便可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每一个价格约130元，不推荐给大家.BD也有已包被好的，价格不清楚.Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常常使用的，好像是

9、要自己铺胶，但听说每一个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情.下面是一些战友提供的价格，详细建议大家接洽代理商咨询.linanping1979战友提供的价格：coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8m，用于肿瘤的侵袭实验.iceyxy战友提供的价格：Millipore的8m的50个1760RMB,0.4m的2000多,是一次性的.梅林战友提供的BD价格： 240RMB一块（6.5um,24孔,12instert），好像是没胶的.liguofan说国产的boyden30块一个.jjyy提供的价格是：corning cat No.3422. 6.5mm trans

10、well with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人平易近币不到.平均每一个20元不到.Transwell小室依照公司的要求，都是一次性使用的.不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的.我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min.sword01战友提供的处理方法：用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水35min，蒸馏水35min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min2.因为我买的

11、是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次操纵的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验.以前的Chemicon ECM550系列，膜很坚固，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的膜已经改用一种很薄很脆的资料，一般只能重复用一次，真黑啊！很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的，大家可以试试.自己没见过，有兴趣的可以自己研究一下.别的，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理.Transwell小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以试试.maojianwen战友的使用方法： trasnwell小室做一

12、次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用密斯用指甲油（注意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边沿.再照紫外. 上层培养液：上层培养液采取无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%0.2% BSA. 细胞：值得注意的是，有侵袭才能的细胞才可用于Transwell侵袭实验.建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP2的表达.如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就自觉停止Transwell侵袭实验，能够会造成不需要的华侈，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百，多则数千，其实不是笔小数目，还是小心为妙.别的，为了让实验成果更分明，可先撤血清让细胞

13、饥饿1224h，再停止实验. 基质胶：常常使用的是人工重构基底膜资料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等.CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝结成胶状，不成逆.同样的东西在sigma叫ECM.zhangyong1036战友提供的价格：BD公司的matrigel 1500左右.如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那末Matrigel就不需要购买了. 下层培养液：下层常常使用含5%10% FBS的培养基，详细浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力衰的细胞可适

14、当提高FBS浓度.下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的. 细胞培养板：常常使用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常常使用.细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板便可以.但要注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套. 此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin，FN，Sigma有售)，这样做的目标是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）.很多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好.如果贴

15、壁欠好的话可以试试看.linanping1979战友认为，如果培养时间很长（24h），细胞还是会掉到下室外面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层涂上FN.别的，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用.2步调2.1 Transwell小室制备2.1.1 无基质胶Transwell小室制备 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4风干.如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN平均涂抹在小室的下面.用胶原（collagen）的话，一班配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上. 水化基底膜：吸出培养板中残存

16、液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37，30min.还有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 6080l (注意体积不成太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 30min使Matrigel聚合成凝胶.2.1.2 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300l预温的无血清培养基，室温下静置1530min，使基质胶再水化.再吸去剩余培养液.2.2 制备细胞悬液 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿1224h，进一步去除血

17、清的影响.但这一步其实不是必须的. 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗12遍，用含BSA的无血清培养基重悬.调整细胞密度至110105，个人认为不要超出5105.详细实验时采取密度要自己试探，因为分歧细胞，其侵袭才能是分歧的.个人经历，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计成果的话将难以计数；而过少的话，能够还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要包管在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在.个人认为，对照组和处理尽能够不要分开计数，因为细胞数目标差别会严重影响实验成果.如果需要对细胞预处理而不克不及不分开计数，那末计数一定要多重复几次，力图准确，尽

18、能够包管对照组和处理组细胞密度一致.2.3 接种细胞 取细胞悬液100200l加入Transwell小室，分歧公司的、分歧大小的Transwell小室对细胞悬液量有分歧要求，请参考说明书.24孔板小室一般200l. 24孔板下室一般加入500l含FBS或趋化因子的培养基，分歧的培养板加的量有分歧要求，详细请参考说明书.这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡发生，一旦发生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留意，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板. 培养细胞：惯例培养1248h（主要依癌细胞侵袭才能而定）.时间点的选择除了要思索到细胞细胞

19、侵袭力外，处理因素对细胞数目标影响也不成忽视.以我的课题为例，我使用的药物不但会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有分明抑制.我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50.用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并没有分明抑制，但24h后，抑制作用就开端出现了.所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那末就难以必定穿过膜的细胞比对照组少，毕竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目自己就比对照组少而引起的了.时间过长不成以，同样，过短也不成，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内能够侵袭

20、才能不会有太大改变.同时从药物被吸收出来，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程.时间点的选择可尽能够长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不克不及有分明变更.别的，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会堆积成团，所以看到细胞不正常贴壁也不妨张，是正常现象在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡发生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重.因此，个人建议，最好接种细胞后12h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡发生.2

21、.4 成果统计检测穿过的细胞数有两种方法：2.4.1 直接计数法2.4.1.1 “贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室外面去.如下图：通过给细胞染色，可在镜下计数细胞 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 染色：常常使用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等.个人推荐采取0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：(1). 不需要固定细胞，直接染色即可.(2). 配制简单方便.(3). 染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数.个人认为这是结晶紫染色最大

22、的优势所在.因为，虽然颠末准确的细胞计数，往往穿过膜的细胞数仍难以准确节制，能够某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下便可以用醋酸脱色后用酶标仪检测.使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则能够会染不上. 细胞计数：我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜停止观察和摄影，把Transwell小室反过来底朝上便可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞.也有很多人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，便可以长期保管，但是这样做小室就成了一次性的了，未免有点华侈.取若干个视野计数细胞个数.论坛里一般采取35个视野，也有人用10个

23、，都是随机选取，个人认为这样选择的视野带有很大的偶尔性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候.我选取16个视野，不是随机选择，而是有固定的位置.我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4.如图，蓝色部分暗示膜的大小，白色圆形暗示视野的大小，绿色方形则暗示摄影时所能拍下的视野的中心部分.这样，每一个小室都拍摄如下图的16个视野停止计数，这样得到成果是比较客观和准确的.2.4.1.2 “非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不克不及附着在膜上，而是掉进下室.如下图：2.4.2 间接计数法间接计数法主

24、要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采取的方法，与常常使用的MTT实验是同样的原理.2.4.2.1 MTT法 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 24孔板中加入500l含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜淹没在培养基中，37 4h后取出. 24孔板中加入500l DMSO，将小室置于其中，使膜淹没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解.取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值.2.4.2.2 荧光试剂检测这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法近似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值.Chemicon的ECM554即

25、属于这类.2.4.2.3 结晶紫检测上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也是近似的.但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程其实不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色.这是用正置显微镜拍摄的图，结晶紫染色，停止细胞计数.第三节 Transwell的其他应用的实验步调1Transwell肿瘤细胞迁移实验过程与Transwell侵袭实验基本一致，分歧的只是不需要铺Matrigel.个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验分明加快，所以细胞量要更大.我做侵袭实验的细胞密度是1105，而迁移实验的密度是1106.别的，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%

26、，迁移实验的浓度是2.5%.2cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步调做了一段时间的原代细胞培养，把经历拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：(1) 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4含0.1胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（GibcoBRL）、无Ca 2、Mg2，无血清的MEM.(2) 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞.(3) 离心后当即用新鲜的上述MEM溶液（含10胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC8 m

27、edium (Biofluids)冲洗一次.(4) 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37C 5CO295% 空气含5% 胎牛血清(GibcoBRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC8 medium孵育610天.(5) 孵育后，经测定跨上皮电阻在10002000之间，即可用于电生理试验.显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此慎密毗连成单层细胞片3. metastasis战友的Transwell

28、 B16细胞的体外迁移实验我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，详细是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下概况涂一层fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的阁房加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，1218小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜接近阁房那一面的细胞，另外一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟

29、，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数.4mci战友的内皮细胞HMEC1迁移实验1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100l用serumfree MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及分歧浓度的药物，下室加入0.6ml serumfree的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并摄影，最后用10%乙酸100l/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值.抑制率计算公式为：抑制率（%）=(OD值给药组OD值无刺激阴性对照)/（OD值不加药阳性对照 OD值无刺激阴性对照) 100%.