对天然多糖的抗氧化活性研究.docx

1、对天然多糖的抗氧化活性研究学院代号 10716专业代码 081302学号 110050801108密级公开陕西中医学院Shaanxi University of Chinese Medicine学士学位论文对天然多糖的抗氧化活性研究学位申请人曹柯专业名称制药工程申请学位类型工学学士学位指导教师姓名王露老师论文提交日期2013年6月对天然多糖的抗氧化活性研究姓名：曹柯 指导老师：王露老师【摘 要】： 多糖是一大类广泛存在于动植物和微生物体内的生物高分子物质， 许多天然多糖具有增强免疫、抗氧化、降血糖、抗病毒等生物活性，天然多糖还 具有毒 副作用小、疗效好等优点，现在多糖已成为天然药物及保健品研发

2、中的 重要组成部分。本文从实验原理、 实验方法等方面对天然多糖抗氧化活性的常见 评价方法进行综述，详细介绍了化学分析法中的自由基（ ABTS自由基阳离子、 DPP H自由基、超氧自由基、羟自由基）清除实验、脂质过氧化抑制实验等评价 方法；描述了以生物细胞为模型的 CAA抗氧评价方法；概述了在动物体内进行 的抗氧化活性评价方法及指标， 为相关领域中抗氧化天然多糖的研究和开发提供 实验理论基础。【关键词】：天然多糖； 抗氧化活性； 评价方法 ；The antioxidant activity of natural polysaccharideresearchName: Cao Ke Teacher

3、:Wang Lu【 abstract 】 : Polysaccharide is a broad categories in a wide variety of plants and microorganisms in vivo biological macromolecule material, many natural polysaccharides have enhanced immune, antioxidant, fall blood sugar, anti-viral biological activity, such as natural polysaccharide has p

4、oison The advantages of small side effects, good curative effect, polysaccharide has now become an important part of natural medicines and health products research and development.This article from the experiment principle and experiment method of natural polysaccharide antioxidant activity of the c

5、ommon evaluation methods were reviewed, detailed introduces the chemical analysis of free radicals (ABTS radical cation, DPPH free radical, superoxide free radical, hydroxyl free radicals) removal experiment, lipid peroxidation inhibition experiment evaluation methods, such as;Describes the biologic

6、al cells as the model of CAA antioxidant evaluation method;Outlined in animals on antioxidant activity evaluation methods and indicators, for oxidation of natural polysaccharides in related areas to provide theoretical basis for research and development.【 key words 】 : Natural polysaccharides ； anti

7、oxidant activity ；evaluation methodology1.天然多糖的抗氧化活性许多天然多糖对各种活性氧 （ Reactive oxygen species ， ROS ）具有清除作 用，能减少脂质过氧化产物丙二醛（MDA的生成量，提高抗氧化酶活性（超氧化物 歧化酶SOD谷胱甘肽过氧化物酶GS Px等），表现出多种途经的抗氧化作 用多糖具有广泛的生物活性，而抗氧化作用是一些多糖抗衰老、抑肿瘤、降血 脂、降血糖的作用机制之一 1 ，近年来国内外已将抗氧化检测用于抗衰老等保健 食品的评价 研究表明，多糖具有清除ROS的抗氧化作用，其可能的作用机理包括：多 糖可以通过捕捉脂质

8、过氧化链式反应中产生的 ROS从而减少脂质过氧化反应链 长度、阻断或减缓脂质过氧化的进行，达到对ROS的直接清除作用；通过与产 生ROS所必需的金属离子发生络合作用，对 ROS起间接清除作用多糖环上的 0H可与产生0曰等所必需的金属离子（如Fe2+、Cu2+等）络合，使其不能产生启 动脂质过氧化的0T或使其不能分解脂质过氧化产生的脂过氧化物，从而抑制 ROS勺产生；多糖可通过提高 SOD GSPx等抗氧化酶的活性，从而发挥抗 氧化的作用2.国内外研究开发现状和发展趋势2.1国内外研究状况多糖作为药物进行研究始于上个世纪 40 年代， 50年代对真菌多糖抗癌效果 的发现使人们开始了多糖的系列化研

9、究。许多研究表明多糖与免疫功能的调节、 细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等有着密切的关系， 具有能量储存、 结构支持、 防御功能和抗原决定性等多方面的生物功能。 最近又 提出了细胞表面糖分子参与细胞一细胞特异性识别的假说， 发现多糖能控制细胞 的分裂和分化、调节细胞的生长和衰老， 其糖链在分子生物学中具有决定性作用。 由于组成多糖的单糖基种类繁多 （目前已知的单糖有 200多种） ，而且糖基可在多 个羟基上以两种可能的键型相互连接 （氨基酸和核苷酸只有一种连接方式 ），因此 它能以最小的结构单元承载最大的生物信息量。 此外，多糖在食品工业、 发酵工 业、石油工业上也有着广泛

10、的应用。 所以近年来多糖成为天然药物研究的一个热 点，在开展多糖资源的开发、多糖结构的分析、多糖药理作用的研究等方面，人 们做了大量的工作。发达国家对多糖生物学的研究也都给予高度的重视。现在多糖已成为天然药物及保健品研发中的重要组成部分， 当今世界排名前 十大制药公司中的九大公司都有糖类药物研发。根据 Thomson Pharma数据库目 前基于糖的上市药物世界上至少有 21 种，现注册正在进行临床前和临床研发的 聚糖（寡糖和多糖）类药物有 137种，分布在 63 个国家和地区。我国十分重视 糖类药物的开发，国家科技部亦把“糖生物学与重大疾病发生发展的机制研究” 列入了未来十年对生物经济引领作

11、用的重大生命科学的应用基础研究课题题目。我国近年来对大量植物来源的多糖， 如黄芪多糖、 牛膝多糖、 猪苓多糖等进 行了研究， 相继报道了这些多糖及糖缀合物具有免疫调节、 抗肿瘤、 降血糖等多 方面的药理作用， 有的已在临床应用， 为创制新药迈出了坚实的一步。 但从总体 上来说由于我国中医药现代化、 国际化水平不高， 目前仍远远落后于发达国家对 多糖产品的研究开发水平。2.2项目背景和重要意义2.2.1 项目背景 近年来，高等植物、藻类及真菌等来源的多糖已成为天然活性产物的一个重 要类型，已发现多种多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗凝血、降血糖和抗病毒等活 性。在研究多糖的生物活性过程中发现， 多糖的

12、抗氧化性与多糖的抗肿瘤、 抗衰 老、抗感染、抗辐射等活性作用密切相关。由于多糖来源广且细胞毒性较低，毒 副作用小，因此对植物多糖的抗氧化活性研究已成为医药界的热门领域。2.2.2重要意义天然多糖按照来源主要分为微生物多糖 （ 真菌与细菌多糖 ） 、动物多糖和植物 多糖，其中的植物多糖包括低等植物多糖 （藻类为主 ）和高等植物多糖据报道， 现已从天然产物中分离出 300 多种多糖类化合物， 包括近 100种植物多糖 由于 植物多糖来源广泛， 应用于生物体的毒副作用小， 对植物多糖的抗氧化活性研究 已成为食品、医药、保健领域的热门课题 1 ，4，5，6 。在天然多糖抗氧化剂的研究中， 通过抗氧化活

13、性评价， 筛选出有益人体健康 的化合物，是经典的研究思路 7 。整个研究中，对天然多糖抗氧化活性的评价是 核心和基础， 对后续研究有重要的指导意义。 不同评价方法的实验原理、 适用范 围各不相同， 所得结果也有差异。 要准确全面地考察天然多糖的抗氧化活性， 需 同时采用多种评价方法。 本文对天然多糖抗氧化活性常见评价方法的原理、 体系 及优缺点进行归纳总结， 以期为相关领域的研究人员进行快速、 准确的实验测试 提供参考。3.体外抗氧化活性化学评价方法3.1 自由基清除方法自由基具有极强的氧化反应能力， 能通过氧化作用来攻击其所遇到的任何分 子，使机体内的大分子物质产生过氧化反应，从而引起机体不

14、可逆损伤 8 ，因此评价天然多糖成分的清除自由基能力是评价其抗氧化活性的一个重要方面。3. 1.1. DPPH清除自由基法实验原理： DPPH（ 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine ，1,1- 二苯基 -2- 三硝基苯肼） 4 是一种在氮氮连接键上含有不对称价电子的氮族自由基，它能稳定存 在，于 517 nm 处有最大吸收值，易与具有氢键供体的化合物发生电子转移反应 9。 DPPH自由基清除实验中，受试物给出的氢原子与 DPPH自由基结合，使反应 溶液的吸光度发生变化， 通过比较实验组与空白组溶液吸光度的变化评价受试物 的抗氧化活性 10。此方法最早由 Blois 提

15、出11，后经大量实验改进， 已成为评价 天然多糖抗氧化成分抗氧化活性的一种常用评价方法 12。但是DPPH方法能与任 何提供电子的化合物进行反应，所以，该方法并不能全面评价抗氧化能力。实验方法：以95%勺乙醇为溶剂配制浓度为O.1mmol/L的DPPH自由基溶液， 此溶液需现配现用。取2.0 mL不同浓度的受试物溶液同2.0mLDPPH溶液混合， 25C避光孵育30 min，于517 nm处测定反应溶液的吸光度，95%S醇做空白对 照13。计算方法如式：DPPH自由基清除度（%）=（1-实白组吸光度）100%2.12 ABTS自由基阳离子清除法实验原理：ABTS2,2-azi nobis-3-

16、ethylbe nzthiazoli ne-6- sulpho nate ,2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基阳离子清除实验是根据 不同浓度受试物对ABTS自由基阳离子溶液吸光度的影响测定中草药成分对 ABTS自由基阳离子的清除能力，该方法最早由Miller提出14，经Re等15改进后被广 泛用于中草药抗氧化成分抗氧化活性的测试。在 Trolox （维生素E的水溶性类似物）被当作标准物用于实验测试时，此方法又称为 TEAC（ trolox equivale nt antioxidant capacity ）法14，实验中，ABTS在氧化剂的过氧化作用下形成一种亚稳态的

17、自由基阳离子，该物质易溶于水和酸性乙醇溶液，于415 nm 660 nm 734 nm、820 nm波长处均吸收。在抗氧化物质的作用下， ABTS自由基阳离子被部分清除溶液吸光度降低通过与空白组实验结果的比较，得到受试物对 ABTS自由基阳离子的清除效果。自由基抗氧化活性评价方法简便实用应用广泛， 但其还存在一些问题，因为抗氧化能力的不同，反应时所用到的抗氧化物质合适浓度难 以确定，因为TEACfi并不能代表所测样品真正的抗氧化能力。实验方法：用纯水配制含 ABTS（ 7 mmol/L）与过硫酸钾（2.45 mmol/L ）的 混合溶液，置于23E的暗处孵育1216h，制备ABTS自由基阳离子

18、基液。用纯 水稀释基液至其在波长734 nm处吸光度为0.700 0.005，得ABTS自由基阳离 子工作液。取0.1mL不同浓度受试物溶液同3.9 mL工作液混合，23C孵育6min, 测量反应混合物在734nm处的吸光度，纯水做空白对照16。计算方法如式：ABTS自由基阳离子清除率（）=（1-实验组吸光度）100%空白组吸光度2.1.3.超氧阴离子自由基清除法实验原理：超氧阴离子（Q ）是需氧细胞线粒体内电子转移产生的一种自 由基17 o由氧分子接收一个电子形成，同生物体内其它活性氧自由基的产生有密 切联系18 o超氧阴离子在生物体内可长时间攻击靶向目标， 对细胞有较强的氧化毒性，与人体的

19、衰老及癌症等疾病的发生有关19 0许多实验体系均可用于模拟细 胞内超氧阴离子自由基的产生及清除， 其中邻苯三酚法使用最为普遍。邻苯三酚在碱性环境中发生自氧化链式反应并释放出大量的超氧阴离子， 超氧阴离子又进一步加速邻苯三酚的氧化，生成一系列在可见光区有特征吸收的中间产物。 在反应体系中加入抗氧化物质可降低邻苯三酚的自氧化速率， 清除产生的超氧阴离子，抑制中间产物的生成，使反应溶液的吸光度减小。通过比较实验组与空白组邻苯 三酚的自氧化速率评价受试物的抗氧化能力20 0该方法测定时间短、灵敏度高（受 试物的实验浓度一般是微克），能较好地模拟超氧阴离子在细胞内的产生及清除 过程。然而，实验体系生成的

20、超氧阴离子不稳定，会进一步氧化，易受杂质影响， 实验中需严格控制测定时间。实验方法：邻苯三酚自氧化速率的测定。 Tris-HCl缓冲液（50mmol/L, pH 值8.2，4.5mL）与纯水（4.2mL）混合，25C 孵育20min,快速力卩入0.3mL 邻苯三酚溶液（3mmol/L，用10mmol/L盐酸配制，经25C预热），混匀后记录5 min内反应溶液在320 nm处的吸光度变化，绘制时间（t）-吸光度（A）曲线，在线 性范围内计算反应物单位时间内吸光度的改变， 得出邻苯三酚的自氧化速率。受试物作用下邻苯三酚自氧化速率的测定：Tris-HCI缓冲液（50mmol/L,pH值8.2 , 4

21、.5mL）与纯水（3.3mL）混合，25 C孵育20 min，快速加入0.9 mL受试物及 0.3mL邻苯三酚溶液（3mmol/L，用10mmol/L盐酸配制，经25C预热），混匀后 记录5min内反应溶液在320nm处的吸光度变化，绘制时间（t）-吸光度（A）曲 线，在线性范围内计算反应物单位时间内吸光度的改变， 得出受试物作用下邻苯三酚的自氧化速率21。计算方法如式：超氧阴离子自由基清除法（ % ）=（ 1-V1） 100%V。式中，Vo自氧化速率；Vi为受试物作用下邻苯三酚的自氧化速率。2.1.4.羟自由基清除法实验原理：羟自由基（OH）是生物细胞内反应活性最强的氧族自由基，可 由超氧阴

22、离子和过氧化氢在金属离子的作用下产生 22。它具有很高的电子还（2310 mV,能与生物体内所有的物质发生反应，如脂类、多肽、蛋白质、核酸 等，对生物大分子产生最强的氧化破坏效应， 引起细胞与组织的氧化损伤，导致 器官的病变与机体的衰老23-25。对羟自由基清除能力的测定是评价天然植物多糖 抗氧化成分抗氧化活性的重要组成部分。通常采用水杨酸竞争捕捉羟自由基的方 式进行测定。实验体系中，过氧化氢在亚铁离子作用下生成羟自由基， 向体系中加入水杨酸捕捉羟自由基，同时产生在可见光区有特征吸收的紫色产物。在反应 体系中加入抗氧化物质，与水杨酸竞争捕捉羟自由基，使生成的紫色产物减少， 溶液的吸光度发生改变

23、。通过比较实验组与空白组反应溶液吸光度的变化评价受 试物的抗氧化活性26。该实验方法步骤简单、灵敏度高、重现性好，能清楚地模 拟生物细胞内羟自由基的清除过程，常用于医学及分子生物学领域抗氧化物质的 筛选。但实验体系对受试物的浓度及 pH值有较高要求，一般适用于酸性或中性 物质。实验方法：1mL受试物溶液与1mL硫酸亚铁溶液（FeSO47H2O 9 mmol/L）、 1mL过氧化氢溶液（10 mmol/L）混匀，37C孵育10min,加入1 mL水杨酸溶液（9mmol/L），混匀后37C孵育30 min，于510 nm处测定反应溶液的吸光度， 纯水做空白对照27。计算方法如式：羟自由基清除率（

24、% ）=（ 1-实验组吸光度 ） 100%空白组吸光度2.1.5 脂质过氧化抑制法实验原理：脂质过氧化主要是指多不饱和脂肪酸在富氧环境中发生的一种氧 化变质，是一类自由基链式反应，既产生自由基，又需要自由基进一步推动反应 28。脂质过氧化会在生物体内产生大量的有毒物质，如活性氧、氢过氧化物及丙 二醛等，弓I起细胞膜功能障碍、生物酶活性降低、细胞成分降解，导致细胞的氧 化损伤与人体的动脉粥样硬化、高血糖、高血脂、高血压等心脑血管疾病的发生、 发展密切相关29-32。在体外，通常采用硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA法检测抗氧化物质对脂质过氧化的抑制效果。该实验方法利

25、用脂质源在亚铁 离子的作用下氧化分解产生丙二醛及其类似物， 在高温和酸性条件下，与硫代巴比妥酸反应生成粉红色产物，该物质在可见光区有特征吸收。向反应体系中加入 抗氧化物质，抑制脂质过氧化的发生，粉红色产物生成量减小，反应溶液吸光度 发改变。通过比较空白组与实验组的吸光度变化评价受试物的抗氧化活性 昭。该方法步骤较多，操作繁琐，实验体系中除包含磷脂外，还含有脂蛋白、脂肪酸等 成分。此外，金属离子的浓度对测定结果有一定影响， 在比较不同实验结果时应注意实验体系的差别。实验方法：使用鸡蛋黄匀浆液（10%体积分数）作为反应的脂质媒介。取 0.1 mL受试物溶液同0.5 mL蛋黄匀浆液、0.4 mL纯水

26、及50卩L硫酸亚铁溶液（FeS047H2O 70 mmol/L）混合，37 C孵育 30 min,迅速加入 1.5 mL 乙酸溶 液（20%体积分数，pH值3.5 ）及1.5 mL硫代巴比妥酸溶液（0.8%,质量浓 度，用1.1%十二烷基硫酸钠溶液配制），高速混匀后95 C 水浴60 min。待 反应混合物冷却至室温，加入5 mL正丁醇，摇匀，混合物5000 r/min离心15 min， 取上清液测定其在532 nm处的吸光度，纯水做空白对照 昭。计算方法如式：脂质过氧化抑制率（%）= （1-实验组吸光度 空白组吸光度100%2.2细胞抗氧化活性评价方法以细胞为基础的活性筛选模型是药物化学中研

27、究药物分配、 吸收及与载体或酶等生物大分子相互作用的有效方法， 能够经济、快速且准确地阐明化学物质在 生物体内的吸收、运输及代谢等现象的机理35。通过细胞模型实验评价天然多糖 抗氧化成分的抗氧化活性（即细胞抗氧化活性评价方法， cellular an tioxida ntactivityCAA ），比化学分析法更具生物相关性，又比动物模型和临床研究更快捷、 经济，是天然多糖抗氧化成分抗氧化活性研究中的一种重要手段36 o Eberhardt 37-38等较早应用细胞培养来测定物质的抗细胞增殖活性，CAA实验将抗 氧化活性的评价提升到一个新的水平，是抗氧化研究领域的突破。继CAA方法建 立后，许

28、多研究小组在CAA方法的基础上建立了其他细胞模型（如Caco-2、RBC AGS的抗氧化活性评价方法，使细胞抗氧化方法得到丰富和发展。但是细胞抗氧 化活性评价方法必须要与体内方法相联系，判断是否与体内实验结果相一致。实验原理：细胞用抗氧化剂混合物（AOx）或天然多糖成分以及本身无荧光的 指示剂混合物2 ,7 -二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA预处理，抗氧化剂结合在 细胞膜上并通过细胞膜进入细胞，DCFH-DA?过细胞膜进入细胞内，细胞酯酶分 解DCFH-DA成极性更强的还原型二氯荧光素 （DCFH）。然后用2,2,-偶氮二异 丁基脒二盐酸盐（ABAP）处理细胞，ABAP分散在细胞中并自发分解

29、形成过氧化自 由基ROO*这些过氧化自由基攻击细胞膜产生更多自由基或活性氧 （ROS*）。细胞内的DCFH极易被氧自由基或活性氧氧化成荧光物氧化型二氯荧光素 （DCH），荧光物DCH可通过分光光度法测定。抗氧化剂可在细胞膜外部结合氧自由基而阻 止其进入细胞，或者在细胞膜内部与 ROS和 ROO结合而阻断DCFH化成DCF 的过程，从而减少DCF的形成。CAA方法测定抗氧化剂阻止人体 HepG-2癌细胞 中ABAP产生的氧自由基导致DFC形成的能力，与对照组相比，细胞荧光物质的 减少量就能反映该化合物的抗氧化能力39 o实验方法：实验细胞按6X 104个/孔的密度接种于96孔细胞培养板，37 C

30、、5% CO条件下孵育24 h，除去培养基，用含5%牛胎血清的VE培养基（PBS洗 涤。每孔用100卩L含不同浓度受试物与25卩mol/L DCFH-DA的混合溶液处理1 h（ 37 C、5%CO2。用 PBS洗涤，除去 DCFH-DA 然后用 100 卩 L ABAP（ 600 卩mol/L ）处理，用荧光酶标仪于538 nm处测定细胞培养物的荧光值，间隔5 min 测定一次，持续1 h。对照组用DCFH-DA和ABAP处理，空白组只用DCFH-DAi 理。绘制荧光值随时间的变化曲线，计算受试物的 CAA值，CAA值越高，抗氧化活性越好40。计算方法如式：CAA=1- ( SA CA)式中，

31、/ SA为受试物荧光值相对于时间曲线下的完整面积；/ CA为空白组 荧光值相对于时间曲线下的完整面积。3.体内抗氧化评价方法抗氧化活性的体外测试是评价天然多糖抗氧化活性的一个重要手段， 但其测定结果并不能完全代表抗氧化物质在生物体内的代谢和利用情况。 天然多糖抗氧化成分往往是成分复杂的混合物，须经消化道各种酶降解条件消化后才能被生物 体吸收，达到靶向细胞发挥作用。而生物体的消化吸收是一个极其复杂的生理过 程，体外简单的化学分析或细胞实验的测试结果与天然多糖活性成分进入生物体 产生作用的实际情况有很大差别41。因此，需在参考体外抗氧化实验的基础上进 行体内抗氧化实验真实评价天然多糖抗氧化成分在生

32、物体内的抗氧化活性。实验原理：实验以动物为模型，对其饲喂受试物，利用生化手段对其各项相 关的生理指标进行测定，通过实验组与空白组各项指标的比较评价受试物在生物 体内的抗氧化活性42。实验方法：选用清洁级大鼠或小鼠为对象，用受试物按实验研究计量及时间 连续饲喂，完成后处死动物，根据实验目的取其血液或组织器官， 测定其中的丙 二醛（MD）超氧化物歧化酶（SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX及过氧化 氢酶（CAT等指标，同空白对照组比较，从而得出受试物在生物体内的抗氧化 能力43体内抗氧化实验建立在生理学、毒理学及病理学基础上，采用生化技术对实验动物进行测试，测定结果真实反映了天然多糖抗氧化成分在生物体内的抗氧化 作用。此外