环境条件及六种农药对白僵菌菌株的影响.docx

1、环境条件及六种农药对白僵菌菌株的影响环境条件及六种农药对白僵菌菌株的影响 学校名称：内蒙古农业大学 作者姓名：朱营辉 摘要研究了不同温度、紫外线及田间常用的2种杀虫剂、2种杀菌剂和2种除草剂对球孢白僵菌菌株的影响,结果表明:在1726温度范围内,球孢白僵菌的菌落直径随着温度的升高而增大,在26条件下达到最大。经紫外线处理,该菌株抗紫外线能力很强,处理与对照菌落直径无差别;在常规浓度下，杀菌剂对球孢白僵菌的菌株生长完全抑制,而杀虫剂的抑制作用较弱,其中诺普信啶虫脒对球孢白僵菌菌株生长反而有促进作用,说明杀虫剂与球孢白僵菌相容性较好。所有除草剂在常规浓度下对菌株生长均有显著抑制作用，诺普信啶虫脒、

2、布溜草和西玛津与球孢白僵菌的相容性相对较好,是菌药混用可能选择的对象。关键词:球孢白僵菌；温度；紫外线；杀虫剂；杀菌剂；除草剂AbstractThis paper researched the influence of different temperatures,ultraviolet radiation, 2 pesticides、2 bactericide and 2 herbicide on Beauveria bassianamycelial growthThe results showed that the Bbassianacolony diameter increased wi

3、th temperature increas-ing at range of 1726.At 26, the clony diameter were the biggest. We had fungi which had strong anti-ultraviolet radiation ability through ultraviolet treatment.Under conventional concentration,there wasnt difference between treatment and control colony diameters.The fungicides

4、 could inhibited the Acetamiprid growth completely.Whereas the insecticides had a slight inhibited effect on the mycelia growth and trichlorfon even accelerated the mycelia growth instead of inhibition.It showed that the insecticides were more compatible with Bbassiana.All herbicide significantly in

5、hibited mycelium growth under conventional concentration.Acetamiprid, Glyphosate IPA Salt and Prometryne showed a comparatively higher compatibility with B.bassiana,providing IPM program good candidates of insecticides and herbicides for mixed use with fungal insecticides.Key words：Beauveria bassian

6、a; temperature; ultraviolet radiation; pesticides; bactericide; herbicide 目 录1引言 51.1白僵菌属的建立及白僵菌属种的分类历史 51.2 温湿度和紫外线对白僵菌的影响 61.2.1温度对白僵菌的影响 61.2.2湿度对白僵菌的影响 71.2.3紫外线对白僵菌的影响 81.3白僵菌的应用及研究进展 81.3.1白僵菌应用中存在的一些问题及对策 81.3.2白僵菌与化学农药混用的研究 91.3.3研究与生防应用前景展望 101.4目的及其意义 112材料和方法 122.1 实验材料 122.1.1实验器材 122.1.

7、2PDA培养基 122.1.3供试菌株 122.1.4供试化学农药 122.2实验方法 122.2.1病原菌的分离纯化及其培养获得孢子粉 122.2.2孢子悬浮液的制备 132.2.3紫外线照射时间对球孢白僵菌菌株生长的影响 132.2.4温度对球孢白僵菌孢子萌发的影响 132.2.5六种农药对球孢白僵菌菌株生长的影响 133结果与分析 143.1紫外线照射时间对球孢白僵菌菌株生长的影响 143.2温度对球孢白僵菌孢子萌发的影响 153.3田间常用农药对球孢白僵菌菌株生长的影响 164结果与讨论 18参考文献 20致谢 241引言1.1白僵菌属的建立及白僵菌属种的分类历史在真菌分类体系中白僵菌

8、一直属于半知菌亚门(Deuteromycontina) 丝孢纲(Hyphomycetales)丛梗孢目( Moniliales) 丛梗孢科 (Moniliaceae) 白僵菌属(Beauveria)1.2，但随着对白僵菌分子进化和系统发育的研究，又将白僵菌重新进行了归类组合。最近美国生物技术信息中心(NCBI)(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/) 将白僵菌归类于双核亚界( Dikarya)子囊菌门( Ascomycota) 盘菌亚门( Pezizomycotina) 粪壳菌纲( Sordariomycetes) 肉座菌亚纲( Hypocreomy-cetidae) 肉座菌目

9、( Hypocreales) 虫草菌科( Cordycip-itaceae) 虫草属( Cordyceps) 。2005 年 Rehner 等19对不同国家和地区的 86 株白僵菌进行了核糖体内转录间隔区( internal transcribed spacer，ITS) 和延长因子的分析，最终将白僵菌分为 A F 6 个进化枝: A球孢白僵菌，包括全世界分布的有性和无性型球孢白僵菌( 或称球孢虫草菌 Cordyceps bassiana) ; B布氏白僵菌; C包含无性型并且源于欧洲和北美洲的球孢白僵菌( B bassiana cf) ; D苏格兰白僵菌和蠕孢白僵菌; E来自亚洲的包括无性型

10、和有性型白僵菌; F多形白僵菌。目前学界都以这6 个分支为准。在我国目前已发现的白僵菌有 4 种，即球孢白僵菌、布氏白僵菌、多形白僵菌和苏格兰白僵菌，其中球孢白僵菌和布氏白僵菌比较常见。1.2 温湿度和紫外线对白僵菌的影响 温湿度和紫外线是影响白僵菌生长培养及应用的重要因素,不同环境来源的菌株对环境条件的要求有所差异,温湿度因素对白僵菌的影响趋势是基本相同的；紫外线影响白僵菌菌株的孢子发芽和菌株生长，甚至杀伤白僵菌分生孢子 22 。在2530,RH 95%100%条件下孢子可以很好的萌发,此范围是白僵菌生长适宜的温、湿度范围23，白僵菌菌株对紫外线的耐受力在种间甚至种内都存在较大差异 24 。

11、1.2.1温度对白僵菌的影响 从分生孢子萌发到菌丝生长直至再次的产孢繁殖,温度影响着白僵菌的各个生长阶段。白僵菌孢子萌发的温度范围为53525,26,生长速度一般随温度的升高而加快,但温度过高会造成萌发率降低、菌丝徒长、产孢量下降,严重的会使孢子失活27,温度过低对白僵菌的产孢量影响不大,但易造成孢子萌发时间推迟、菌丝生长稀疏27,28。在2326条件下白僵菌会达到最佳的生长状态,在此范围内孢子萌发率、菌落生长速率和产孢量等生理指标均会随着温度的升高而增大,在26条件下的各项生物学指标均会达到最高25,24,29。室内外研究发现,适宜白僵菌孢子萌发及菌丝生长的温度,也是防治害虫的最佳温度,低温

12、(17以下)或高温时(29以上),白僵菌生长受抑制,杀虫效果会显著降低29-34。2326为感染小猿叶甲2龄幼虫的最适温度范围,在第10天死亡率达到96%;在25时对棉铃虫的致病力最强,对2龄幼虫第8天的死亡率是91.7%,高于15下的16.7%,且死亡率随幼虫龄期增长而降低;在1828温度范围内,白僵菌在第6天对桃蚜成蚜的致死率可达到100%,21对桃蚜成蚜的毒效最快,LT50仅为3.7d,明显低于11条件下的LT50(18.7 d)30,31,34。在适宜温度下,白僵菌于1014 d内可成功侵染害虫,使寄主达到死亡高峰,并达到良好的防治效果;低温下分生孢子萌发时间相应延迟,导致白僵菌致病力

13、降低。1.2.2湿度对白僵菌的影响相对湿度是影响白僵菌萌发、生长及对害虫毒力的关键性因子。相对湿度低不利于孢子萌发35,高湿环境下白僵菌才能正常萌发生长,造成昆虫病害的流行。试验表明,在RH 75%时,无论温度如何都不能使孢子萌发,RH 85%以上的环境可使孢子萌发并侵入昆虫表皮26,大于RH 90%最有利于白僵菌对害虫的感染32,33,36,在接近RH 100%时杀虫效果最好34。白僵菌使用形式在一定程度上影响到孢子的萌发及对害虫的侵染水平,不同制剂的含水量有所差别,选择适当的菌剂可提高白僵菌实际的应用效果。采用菌悬液施药可比直接施撒菌粉的萌发时间提前1224 h,菌丝生长速度加快,产孢时间

14、可提前2426 h32。林华峰等38试验表明,菌液中孢子在24 h内萌发,第7天萌发率达90%,对马尾松毛虫幼虫第8天致死率达50%,第10天可全部死亡;而菌粉中孢子在72 h后开始萌发,第10天萌发率不足70%,幼虫死亡速率较慢,直至第16天全部死亡。有研究认为,油剂对害虫的致病力高于水剂39,施用油剂防治小菜蛾7 d的累计死亡率是40.82%,高于水剂的22.48%,原因可能是油剂在昆虫体表的附着力强于水剂,使孢子有充足的时间在体表萌发并侵染。一定条件下制剂中孢子的萌发状况也会影响到白僵菌对害虫的毒力,James 12研究发现施用含有已萌发孢子的白僵菌菌剂比未萌发孢子对害虫将有更强的毒力,

15、前者对3龄银叶粉虱幼虫的致死率是后者的2.45倍,致死中时缩短21 h,表明已萌发的孢子对虫体的侵染更加迅速。为使孢子在较干燥的环境中更好的萌发,可以通过向白僵菌制剂中加入适当助剂来调节菌株的生长,在白僵菌菌液中加入总含量为164.6 mg/g的赤藻糖醇与丙三醇助剂后,萌发率高于235.7 mg/g海藻糖的处理,并使菌丝生长速率加快37。适量助剂的加入可以调节白僵菌孢子的生理机能,增强菌剂展着性及耐旱性,从而进一步提高白僵菌对田间害虫生防的控制力度。此外,在灌溉水源较多地区,空气及土壤的相对湿度较大,可使白僵菌生长速度加快,对虫体致病力增强40,41,此时集中施菌将更有利于菌剂药效的发挥。 1

16、.2.3紫外线对白僵菌的影响 紫外线对活体细胞的伤害主要表现为使DNA变性和促使细胞内形成活性氧自由基的毒害作用42。日光照射(尤其是其中的UV-B)对白僵菌的田间存活率具有很大的负面影响43,影响孢子发芽和菌丝生长,甚至杀伤白僵菌分生孢子22。黄长春44等的研究证明紫外光对球孢白僵菌孢子的影响包括导致孢子活力降低和造成孢子延迟萌发两方面，从而降低了菌株毒力。应盛华45等的研究中，荧光增白剂和抗坏血酸 Vc 的紫外保护作用最优。张晓敏46等研究在不同紫外照射时间下，得出0. 15% 浓度的抗坏血酸 Vc 对长时间紫外照射的保护作用较强。何末军47等的研究表明不同菌株抗紫外线能力不同。研究还表明

17、,白僵菌对UV-B的辐射耐受力在种间甚至种内都存在较大差异24。此外,来源于低纬度的菌株往往具有较强的紫外辐射耐受力43。1.3白僵菌的应用及研究进展 对白僵菌研究较多的国家有前苏联、美国、日本、法国、德国等。前苏联在20世纪70年代批准登记为Boverin的微生物杀虫剂即来源于球孢白僵菌,该药剂主要用来防治马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、苹果小食心虫(Grapholitha inopi-nata)、小麦盾蝽(Poecilocorissp.)、玉米螟(Ostri-nia furnacalis)和甜菜象甲(Bothynoderes punc-tiventris)

18、等47。我国应用白僵菌生产的杀虫剂可防治40多种害虫,目前生产上主要利用其防治松毛虫、玉米螟和水稻叶蝉等害虫,防治农林害虫每年达67万hm2以上。刘爱英等研究了布氏白僵菌(B.brongniartii)、球孢白僵菌(B. bassiana)对烟草甲虫(Lasiderma serricorne)的致死效果,结果显示,球孢白僵菌对烟草甲虫的防治效果最好,孢子在108个/mL时,对烟草甲虫的致死中时为10d48。张永贞等在室内恒温条件下测定了球孢白僵菌菌株孢子不同含量的悬浮液对桃蚜的毒力,结果表明,桃蚜的死亡率、僵虫率与孢子含量成正比,最高死亡率可达90%,将僵虫接入健康桃蚜种群,室温下僵虫率随处理

19、天数的增加逐渐增多,第20天时僵虫率可达48%49。另外,Cruz等的研究表明,应用白僵菌的不同菌株混合接种可以显著提高对咖啡豆钻心虫的生防效果,还能增强白僵菌的遗传稳定性50。1.3.1白僵菌应用中存在的一些问题及对策 随研究的深入,人们认识到,白僵菌存在着菌种严重退化问题。如何维持优良菌株的特性,保持稳定的高产孢率和高毒力一直是工业生产中的关键。依靠自然筛选和诱变育种获得高毒力菌种资源已远远满足不了实际生产的需求,今后原生质体融合技术和基因工程技术将是今后遗传育种的方向之一。同时,应进一步研究菌种毒力退化机制,加强研究引起白僵菌变异的分子生物学和生物化学基础以及影响基因表达的因素,以进一步

20、寻找保持菌株稳定性的有效途径47。作为一种理想的白僵菌杀虫剂的生产工艺,应具备高效性、配套性、稳定性、可控性、规模性等,而我国现有白僵菌生产工艺,即使是目前最为先进的液固两相工艺,在孢子生产过程中也存在着规模小不易扩大生产等诸多缺点,离上述目标仍有很大差距。要实现上述目标,固态发酵反应器上的突破是关键。通过反应器系列设备的相应改进与条件控制,从而满足白僵菌发酵过程不同阶段的不同条件43。在白僵菌制剂方面,目前各种白僵菌制剂都存在着保存困难、货架贮存期短等问题,这是制约产品推广应用的主要因素。今后需在剂型研究上进行创新,针对白僵菌的生物学特性研制出具有稳定、易于储藏的制剂产品是重要的研究方向。产

21、品的剂型仍将是今后亟需深入研究的重点问题,这也是实现产品标准化的前提。从现有研究结果看,寻求工业可行的经济方便的干燥手段,使孢子含水量降到5%而萌发率不低于90%是解决储藏稳定性的关键51。1.3.2白僵菌与化学农药混用的研究 由于化学农药残留对农产品和环境的污染日益严重,社会经济的发展和人们环保意识的提高,公众对化学农药残留的忧虑加深,环境友好型的生物农药的应用受到越来越高的重视52,但目前包括微生物农药在内的整个生物农药所占农药市场份额仅约为10%53。在害虫的生物防治方面,真菌是研究、生产和应用最多的生物类群之一54。据最新统计55,除我国以外,世界上先后有171种真菌杀虫剂产品问世,其

22、中球孢白僵菌Beauveria bassiana和金龟子绿僵菌Metarhiz-ium anisopliae各有58种产品,各占产品种类总数的339%。根据我国农业部农药检定所统计, 2008年我国有11种真菌杀虫剂登记,其中6种是球孢白僵菌产品。自20世纪70年代以来我国应用该菌防治农林害虫的规模一直居世界前列56。然而,与化学杀虫剂相比,真菌杀虫剂具有杀虫率不高和杀虫速度较慢的缺点。近年来通过基因工程手段对生产菌株进行改造虽有较快进展,但由于对转基因生物环境安全性的严格评估程序,目前距释放使用尚需时日,因此与化学农药混用这种传统使用方式仍是提高防治效果的有效手段57。前苏联和波兰等东欧国家

23、在使用球孢白僵菌制剂Boverin防治马铃薯叶甲Leptinotarsa decemlineata时多与一些化学杀虫剂混合使用58。20世纪80年代, Anderson和Roberts59已开始进行相容性室内试验。本世纪以来,许寿涛等60测定了10种常用农药与球孢白僵菌的相容性,发现吡虫啉、蚜虱灵、灭多威和氟虫腈与孢子的相容性好,其中吡虫啉和蚜虱灵即使在田间常规使用浓度下孢子萌发率也在95%以上; Oliveira和Neves61研究了咖啡种植园使用的8种杀虫剂与球孢白僵菌的相容性,发现混用后-氯氰菊酯、噻虫嗪和氟氯氰菊酯在推荐浓度及其半量浓度下对孢子萌发的抑制程度较低;邝灼彬等62发现供试杀

24、菌剂对球孢白僵菌的菌丝生长均有较强的抑制作用;而杀虫剂则对菌丝生长影响不大,其中多杀菌素、噻虫嗪、阿维菌素、甲基毒死蜱和丁硫克百威在第5d时对菌落生长反而有促进作用;李正跃和张青文63测定了球孢白僵菌高毒力菌株与10种生物和化学农药的相容性,发现与其中的苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂、10%吡虫啉可湿性粉剂、25%多杀菌素悬浮剂及松毛虫质型多角体病毒可湿粉剂等在推荐浓度下相容性良好,可配伍使用; Rashid和Baghdadi64这些研究结果表明:农药种类尤其是杀虫剂的种类与真菌的相容性无规律可循。因此,对于市场上新推出的农药,都应通过相容性试验找出其与真菌的相容水平,确定与菌剂混配的亚致死剂量以及

25、混用的增效作用,以便田间菌药混用时参考65。1.3.3研究与生防应用前景展望 在害虫防治中使用化学农药造成的环境污染已引起了世人的广泛关注。我国是一个农业大国,作物种类多,害虫的危害严重,因此化学农药的用量也大得惊人。我国每年因农药残留超标影响出口的损失达1000亿元以上。且化学农药的大量使用,严重危害了人畜的健康并污染水资源,而且使害虫的抗性越来越大。这就要求我们对病虫害的防治要改变以传统的有机合成杀虫剂为主的模式,寻求可持续的害虫防治新途径。生物农药以其生产方便、成本低廉、使用安全、无残毒、可扩散流行和害虫不易产生抗药性等特点,成为世界各发达国家竟相发展的高科技之一,同时也是绿色减灾的最重

26、要途径之一。但目前由于我国生物农药品种少、防效不稳定等原因,与实际需要还有很大的差距,在我国大力开发研制生物农药势在必行。因此,虫生真菌作为一类宝贵的生物资源,未来将会得到进一步研究、发掘,在防治害虫实践中发挥更重要的作用。中国现已记载的虫生真菌与存在的虫生真菌资源相比还很少。多年来,人们所注意的虫生真菌主要是集中于那些常见的、能自然感染昆虫的真菌上。事实上,在自然界还有很多未经系统利用的虫生真菌,系统的资源调查收集还很有限,从事资源方面研究的人很少,亟待加强队伍建设,进一步对虫生真菌的资源调查收集,以获得更多更优良的菌株。随着对虫生真菌研究的深入和人们环保意识的增强,虫生真菌作为一种缓效、环

27、保的生物防治材料会越来越受到重视。近年来,随着全球经济一体化进程加快和国际交流飞速发展,外来入侵生物(植物、动物和微生物)传播扩散的形势变得非常严峻,由此造成的经济损失(年均近1000亿元)、环境问题和社会影响越来越大66。因此,对外来入侵生物及其防控技术研究已经引起世界各国的高度重视,外来入侵害虫的生物防治也是其中的重要研究领域之一。我国的外来入侵害虫及动物估计超过100种,重大的害虫有马铃薯甲虫、螺旋粉虱、椰心叶甲、烟粉虱、美国白蛾、柑橘大实蝇、美洲斑潜蝇等66,67,对这些害虫上虫生真菌的研究,应当引起高度的重视,其将会成为外来入侵生物研究的一个热点和重点领域。昆虫真菌分子生物学研究已经

28、取得了一定的进展,但对于这方面的研究还刚刚起步且进展较缓慢。因此,对于昆虫病原真菌的分子生物学和生物工程技术的研究需要更多的重视和加强,这将会对昆虫病原真菌产生全新的认识,同时还可能促进虫生真菌研究及其在害虫生物防治的应用更快速地发展。 1.4目的及其意义 目前在害虫的化学防治方面导致了一系列令人忧虑的问题，例如：第一，引起了害虫的抗药性；第二，杀害天敌、破坏自然平衡、引起害虫的猖獗或次要害虫的大发生；第三，环境污染，产生残毒问题。而害虫的生物防治是解决上述问题的重要途径，其具有以下优点：首先，它能有效的控制害虫；其次，能够减少环境污染，降低残毒的遗留量；再次，降低农业成本，增加农民收入。对虫

29、生真菌的研究显得尤为重要。用白僵菌防治害虫，对施菌区的节肢动物区系不会造成伤害，对害虫的寄生性天敌影响也较小。近年来，尤其是2008、2009年草地螟遍布整个内蒙古地区，对农、牧、林业造成了严重的损失的同时也破坏了生态系统的平衡。白僵菌在林业害虫(松毛虫)防治方面应用广泛，但是在草地螟防治方面甚少，本实验从自然感染的草地螟虫尸上分离并经纯化得到了白僵菌菌株（经镜检为球孢白僵菌），经培养得到了大量的球孢白僵菌的孢子粉，通过对白僵菌致病机理的掌握可知,其孢子萌发与否对其浸染性起着决定性的作用,而环境是否适宜是其萌发的必备条件。本实验本着掌握白僵菌菌株的最适生长环境条件目的,试图测出常见环境因子对球

30、孢白僵菌菌株的影响的数据；试验拟选用近年来农药市场上销售的2种杀虫剂、2种杀菌剂和2种除草剂,分别测定其对内蒙古四子王旗球孢白僵菌菌株生长速度的影响,以综合评价温度、紫外线以及几种田间常见农药对球孢白僵菌生长的影响,为合理开发应用球孢白僵菌制剂防治害虫提供科学依据。2材料和方法2.1 实验材料2.1.1实验器材 刮铲，移液枪，打孔器，培养皿，三角瓶，酒精灯，接种针，移液管，灭菌注射器20ml一支、5ml七支，三角尺，直径5mm枪头等等。2.1.2PDA培养基 称取去皮后的马铃薯200 g,将其切成小块,加水煮沸30min,滤去马铃薯块,将滤液补充至1 L,加葡萄糖20 g,琼脂18 g。2.1

31、.3供试菌株 实验用的白僵菌菌株，分离自内蒙古四子王旗自然感染的草地螟幼虫，再经纯化培养后而得到的白僵菌孢子粉。2.1.4供试化学农药 供试6种农药见表2-1。其中井唑酮、多菌灵锰锌为杀菌剂；诺普信啶虫脒、杀螟丹为杀虫剂;西玛津、布溜草为除草剂。表2-1供试农药农药田间浓度配制浓度出产公司井唑酮600-1000倍30g/100ml天津市天雨一农科技有限公司多菌灵锰锌1500-2000倍1g/150ml山东荣邦化工有限公司诺普信啶虫脒3000-4000倍1g/150ml深圳市诺普信农化有限公司杀螟丹1500-2000倍2g/150ml江苏天容集团股份有限公司西玛津1300-1800倍10g/100ml上海颖心实验室设备有限公司布溜草800-1200倍20ml/150ml大连瑞泽农药股份有限公司2.2实验方法2.2.1病原菌的分离纯化及其培养获得孢子粉将虫尸在无菌条件下用0.1%的升汞表面消毒30s，75%酒精表面消毒2min，无菌水冲洗3次，然后接种在真菌PDA培养基上，置于25培养箱中培养，观察生长情况。用接种针挑取培养好的分离菌的少量孢子,配成孢子悬浮液,依次稀释成3个不同的浓度,用灭菌吸管吸取少量悬浮液放在PDA培养基平板中央,然后涂布平板,置于25培养3d。观察三个平板上长出菌落的稀密情况。挑取数个单个菌