超好研究生分子生物学课件-RNA干扰(2).ppt

1、 一、一、RNA干扰（干扰（RNA interference,RNA i）概念：）概念：RNA i 是指由短双链是指由短双链RNA诱发同源诱发同源mRNA 降解过降解过 程，是一种转录后基因沉默现象。程，是一种转录后基因沉默现象。RNA i技术是在转录技术是在转录后水平抑制基因表达的一种研究基因功能的有力工具。后水平抑制基因表达的一种研究基因功能的有力工具。RNA i 的发现源于两类研究：一类是转基因植物的的发现源于两类研究：一类是转基因植物的研究，二是反义的研究。研究，二是反义的研究。1990年由年由Napoli等领导等领导的研究小组将基因转入牵牛花的实验中首次发现的研究小组将基因转入牵牛花

2、的实验中首次发现转录后基因沉默现象（转录后基因沉默现象（post-transcriptional gene silencing,PTGS）。）。1998年，华盛顿卡耐基研究院的年，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸大学医学院的和马萨诸大学医学院的Craig Mello首次证实：首次证实：1995年年Su Guo 博士在利用反义阻断线虫博士在利用反义阻断线虫par-1基因表达时出现的正义抑制基因表基因表达时出现的正义抑制基因表达的现象是由于污染微量双链而引起的，达的现象是由于污染微量双链而引起的，并将这种由双链引起特异性基因抑制现象并将这种由双链引起特异性基因抑制现象称为干涉。称

3、为干涉。双链双链RNA（dsRNA）之所以能引起特异性基）之所以能引起特异性基因抑制，是其激活细胞内一种称为因抑制，是其激活细胞内一种称为icer的酶复的酶复合体所致合体所致 icer是是由核酸内切酶和解旋酶等构成，能识由核酸内切酶和解旋酶等构成，能识别异常双链别异常双链RNA并将其切割成短并将其切割成短dsRNA（21-23bp）,后者可进一步与被激活的后者可进一步与被激活的icer结合形成结合形成RNA诱导的沉默复合物形成（诱导的沉默复合物形成（RNA induced silencing complex,RISC)。RISC是通过是通过icer中的中的RNA 解旋酶将双链解旋酶将双链RNA

4、变变成两个互补的单链成两个互补的单链RNA，然后单链，然后单链RNA识别细胞内识别细胞内与其互补的靶与其互补的靶RNA分子，并相互结合，这时分子，并相互结合，这时icer中中的核酸内切酶将的核酸内切酶将RNA分子切断，使靶分子切断，使靶RNA分子失去分子失去编码蛋白质的功能。编码蛋白质的功能。RNAi一般分叁个阶段：一般分叁个阶段：1.长双链长双链RNA被细胞内的双链特异性核酸内切酶切成被细胞内的双链特异性核酸内切酶切成21-23bp短双链短双链RNA，又称小干涉性，又称小干涉性RNA(small interfering NA,siRNA)；.siRNA与细胞内某些酶和蛋白质等结合形成与细胞内

5、某些酶和蛋白质等结合形成RISC.RISC识别与识别与siRNA有同源性的有同源性的mRNA，并在特定位，并在特定位点切割点切割mRNA 二、二、二、二、MechanismMechanism of RNA i of RNA i：siRNA（short interference RNA)formation dsRNA 21-25nt RNA(si RNA)siRNA 的结构特征：的结构特征：*5末端为磷酸基末端为磷酸基 *3 末端为羟基，并且有末端为羟基，并且有2 个突出的个突出的单链核苷酸单链核苷酸 Dicer,ATP,RDE-4,DCR-1 RNARNA诱导的沉默复合物形成诱导的沉默复合物形

6、成诱导的沉默复合物形成诱导的沉默复合物形成 （RNA induced silencing complex,RISCRNA induced silencing complex,RISC)siRNAsiRNA incorporated into RISC incorporated into RISC RDE-1(adaptorRDE-1(adaptor)RISC RISC RISC:ATP,RNA RISC:ATP,RNA 解旋酶（解旋酶（解旋酶（解旋酶（helicasehelicase）,多种蛋多种蛋多种蛋多种蛋白质，白质，白质，白质，RNA-directed RNA RNA-directed

7、RNA polymerase(RdRPpolymerase(RdRP),),siRNAsiRNA核酸内切酶（核酸内切酶（核酸内切酶（核酸内切酶（SlicerSlicer），），），），识别和切割靶识别和切割靶mRNAmRNA RISC RISC RISC RISC +target mRNA target mRNA antisenseantisense siRNAsiRNA+target mRNA+target mRNA RISC cleaves the target mRNA in the region RISC cleaves the target mRNA in the region co

8、vered by the covered by the siRNAsiRNA*RISCRISC的的siRNAsiRNA有着高度的序列特异性，通过碱基配对有着高度的序列特异性，通过碱基配对定位到同源定位到同源mRNAmRNA，RNARNA酶在酶在siRNAsiRNA-mRNA-mRNA结合体结合体33端端1212个碱基的位置切割个碱基的位置切割mRNAmRNA.dsRNAdsRNA I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I

9、 I I I I I Dicer RNAIII,ATPDicer RNAIII,ATP DCR-1,RDE-4DCR-1,RDE-4 siRNAsiRNA I I I I I I I I I I I II I I I proteins,proteins,ATP,RNAaseATP,RNAase RDE-1 RDE-1 other factorsother factors RISCRISC mRNA target recognition RISC mRNA target recognition RISC I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

10、I I I I I I I I I I I I I I I I I I I mRNA cleavage mRNA cleavage RdRPRdRP I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I degraded degraded RNARNA I I I I I I I I I I I I I I I I I Illustration of the mechanism of Illustration of t

11、he mechanism of RNAiRNAi 1.1.The step(mRNA target recognition)could be The step(mRNA target recognition)could be envisioned to occur in two forms,either by envisioned to occur in two forms,either by removing one of the strands of the removing one of the strands of the siRNAsiRNA duplex duplex from R

12、ISC or by keeping the two from RISC or by keeping the two siRNAsiRNA strands strands spatially separated.spatially separated.2.2.AntisenseAntisense siRNAsiRNA recognizes the target mRNA,and recognizes the target mRNA,and RISC cleaves the target mRNA in the region of RISC cleaves the target mRNA in t

13、he region of covered by covered by antisenseantisense siRNAsiRNA.3.After target RNA cleavage,the mRNA cleavage 3.After target RNA cleavage,the mRNA cleavage products are released and RISC may be reactivated products are released and RISC may be reactivated for another round of catalytic target RNA c

14、leavage.for another round of catalytic target RNA cleavage.4.The mRNA cleavage products may be used for 4.The mRNA cleavage products may be used for dsRNAdsRNA synthesis by the synthesis by the RdRPRdRP.5.5.siRNAsiRNA may be elongated by may be elongated by RdRPRdRP,and resulting,and resulting dsRNA

15、dsRNA again enters the again enters the RNAiRNAi pathway.pathway.三、三、RNAi的特点 1.1.RNAiRNAi具有高度的基因特异性具有高度的基因特异性具有高度的基因特异性具有高度的基因特异性 *靶基因外显子同源的编码序列靶基因外显子同源的编码序列靶基因外显子同源的编码序列靶基因外显子同源的编码序列 *两个基因在核苷酸水平上有两个基因在核苷酸水平上有两个基因在核苷酸水平上有两个基因在核苷酸水平上有80%80%同源，同源，同源，同源，RNAiRNAi 的的的的 阻抑作用可被共享。阻抑作用可被共享。阻抑作用可被共享。阻抑作用可被共享

16、。2.2.靶向扩增靶向扩增靶向扩增靶向扩增 *RdRPRdRP的参与，靶的参与，靶的参与，靶的参与，靶 mRNAmRNA为模板，为模板，为模板，为模板，dsRNAdsRNA形成形成形成形成 3.3.转移转移转移转移RNAiRNAi 指沉默信号沿着特定的基因移动指沉默信号沿着特定的基因移动指沉默信号沿着特定的基因移动指沉默信号沿着特定的基因移动 *由于靶向扩增，由于靶向扩增，由于靶向扩增，由于靶向扩增，siRNAsiRNA可以和靶序列可以和靶序列可以和靶序列可以和靶序列33端以外的其他部端以外的其他部端以外的其他部端以外的其他部 位结合位结合位结合位结合 *RISCRISC引起染色体结构变化生成的异常引起染色体结构变化生成的异常引起染色体结构变化生成的异常引起染色体结构变化生成的异常mRNAmRNA4.4.高效性高效性高效性高效性 其作用效率比反义其作用效率比反义其作用效率比反义其作用效率比反义RNARNA还要高很多还要高很多还要高很多还要高很多 四、RNAi的应用前景基因功能的研究基因功能的研究利用利用RNAiRNAi技术研究特定基因功能的程序主要包括：确定目的技术研究特定基因功能的程