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1、一、基因诊断一、基因诊断感染性疾病的诊断：感染性疾病的诊断：人类感染了外源的病毒、细菌等引起的传染性疾病的诊断人类感染了外源的病毒、细菌等引起的传染性疾病的诊断可以直接分析患者的组织、器官或血液等来确定是否有外可以直接分析患者的组织、器官或血液等来确定是否有外来病源性生物的基因。来病源性生物的基因。如如HIVHIV的的DNADNA序列已经搞清，可以根据该序列设计合成一段序列已经搞清，可以根据该序列设计合成一段引物，再从受检人的血液或组织中抽提极微量的引物，再从受检人的血液或组织中抽提极微量的DNADNA为模板为模板进行进行DNADNA的扩增，如获得与的扩增，如获得与HIV DNAHIV DNA

2、序列相同的特定长度的序列相同的特定长度的DNADNA片段，即可确定受检者携带片段，即可确定受检者携带HIVHIV病毒。病毒。第第1616章章 遗传病遗传病的的基因诊断基因诊断和基因治疗和基因治疗人类遗传性人类遗传性疾病的产前诊断疾病的产前诊断人类有人类有200200多多种遗传病可用基种遗传病可用基因诊断技术作出因诊断技术作出准确的诊断，甚准确的诊断，甚至在发病前和出至在发病前和出生前作出诊断。生前作出诊断。如胎儿的羊水如胎儿的羊水和胎盘绒毛细胞和胎盘绒毛细胞可以从母体内取可以从母体内取得，取出的细胞得，取出的细胞可进行染色体核可进行染色体核型、性别、生化型、性别、生化和基因组缺陷的和基因组缺陷

3、的检测。检测。镰镰形形细细胞胞贫贫血血症症是是编编码码血血红红蛋蛋白白链链的的一一个个决决定定谷谷氨氨酸酸的的密密码码子子GAGGAG变变成成了了编编码码缬缬氨氨酸酸的的密密码码子子GTGGTG，从从而而使使血血红红蛋蛋白白质质分分子子结结构构和和功功能能发发生生根根本本的的改改变变，该该患患者者的的红红细细胞胞由由正常的园盘形变成镰刀形。正常的园盘形变成镰刀形。正常红细胞正常红细胞镰形红细胞镰形红细胞检测原理：检测原理：由由于于血血红红蛋蛋白白基基因因上上单单个个核核苷苷酸酸的的替替换换(AT)(AT)，使使该该部部位位的的正正常常序序列列由由CCTGAGGCCTGAGG变变成成CCTGCC

4、TGT TGGGG，从从而而使使患患者者DNADNA中中消消失失了了一一个个可可被被特特定定内内切切酶酶(MstMst II)II)切切割割的的切切点点。MstMst IIII识识 别别 的的 序序 列列 为为CCCCT TN NAGGAGG。下下图图为为正正常常和和异异常常蛋蛋白白、基基因因和和内内切切酶酶识识别别位位点点变变化图。化图。1 1检测限制性位点的变化检测限制性位点的变化 SouthernSouthern杂交检测镰形细胞贫血症杂交检测镰形细胞贫血症方方法法：提提取取羊羊水水或或绒绒毛毛细细胞胞DNADNA，用用限限制制性性内内切切酶酶MstMst IIII对对DNADNA酶酶解解

5、，经经电电泳泳、变变性性和和SouthernSouthern转转膜膜后后，用用放放射射性性标标记记的的-株株蛋蛋白白基基因因探探针针对对膜膜上上的的DNADNA作作杂杂交交，根根据据放放射射自自显显影影后后的的胶胶片片上上杂杂交交斑斑点点的的多多少少和和位位置可作出诊断。置可作出诊断。正常人正常人的的-珠蛋白基因珠蛋白基因(AAAA)中有中有3 3个个MstMst IIII切点切点，可将该，可将该DNADNA上上切成切成0.2kb0.2kb和和1.1kb1.1kb长的长的2 2个片段；异个片段；异常患者的常患者的珠蛋白基因（珠蛋白基因（SSSS）中，只有中，只有2 2个切点个切点，可将该，可将

6、该DNADNA切一切一条长条长1.3kb1.3kb的片段。突变携带者（的片段。突变携带者（杂杂合合子子），其），其-珠蛋白等位基因中，珠蛋白等位基因中，一个是正常的基因一个是正常的基因，它有，它有3 3个切点，个切点，切成切成2 2个片段；个片段；另一个携带突变另一个携带突变的基的基因片段中只有因片段中只有2 2个切点，产生一个大个切点，产生一个大的片段。的片段。如如果果某某一一特特定定核核苷苷酸酸发发生生异异常常，可可用用该该基基因因相相应应区区段段上上正正常常的的野野生生型型序序列列的的寡寡核核苷苷酸酸作作为为探探针针，经经分子杂交确定。分子杂交确定。杂杂交交时时的的温温度度是是重重要要条

7、条件件。因因为为野野生生型型和和突突变变型型只只差差一一个个核核苷苷酸酸，都都可可能能与与正正常常野野生生型型探探针针杂杂交交。在在较较高高温温度度时时，互互补补序序列列才才能能杂杂交交，只只有有一一个个错错配配碱基的碱基的DNADNA也不能杂交也不能杂交。2 2、等位基因特异性等位基因特异性序列检测序列检测(allele-specific allele-specific oligonucleotides,ASO)oligonucleotides,ASO)3.PCR3.PCR检测法检测法 用用SouthernSouthern杂杂交交法法：对对镰镰形形细细胞胞贫贫血血症症作作产产前前诊诊断断需需

8、要要足足够够的的细细胞胞，并并需需提提取取纯纯化化DNADNA，并并作作酶酶切切和和杂杂交交等等步步骤骤，不不但但所所需需时时间较长，而且有一定的风险。间较长，而且有一定的风险。PCRPCR法：法：根据根据-珠蛋白基因序列设计二条引物；取得极微量胎珠蛋白基因序列设计二条引物；取得极微量胎儿绒毛细胞或患者血液，裂介细胞粗提儿绒毛细胞或患者血液，裂介细胞粗提DNADNA，然后作，然后作PCRPCR扩增，无扩增，无论是正常或异常者都会产生论是正常或异常者都会产生1.3kb1.3kb长的长的DNADNA片段。再对扩增样品作片段。再对扩增样品作酶切和电泳，其结果可直接从电泳图获得：该法简便，只需微量酶切

9、和电泳，其结果可直接从电泳图获得：该法简便，只需微量细胞就可作出诊断。细胞就可作出诊断。正常正常异常异常携带者携带者1.3电1.1泳0.2PCRPCR原理原理（1 1）变变性性，在在9595高高温温下下模模板板双双链链DNADNA解解开开成成单单链链DNADNA。（2 2）退退火火，将将反反应应系系统统降降至至5555，使使引引物物能能与与模模板板单单链链DNADNA的的特特定定部部位位配配对对结结合。合。（3 3）链链延延伸伸：在在7272，以以单单链链为为模模板板，在在引引物物的的3 3 末端以互补原则合成新链。末端以互补原则合成新链。每每一一循循环环可可使使目目的的基基因因扩扩增增一一倍

10、倍，经经3030个个周周期期可可扩扩增增2 23030目目的的基基因因片片段段。PCRPCR技技术术是是DNADNA操操作作的的重重大大发发明明，MullisMullis等等获获得得了了19931993年年诺诺贝尔奖。贝尔奖。1.4.基因芯片技术基因芯片技术 （DNAmicroarraysorDNAchips)概概念念：基基因因芯芯片片技技术术是是 D DN NA A 杂杂交交探探针针与与半半导导体体工工业业技技术术相相结结合合的的产产物物。将将各各种种探探针针固固定定于于支支持持物物上上后后与与带带有有荧荧光光标标记记的的D DN NA A 样样品品分分子子进进行行杂杂交交，通通过过检检测测

11、每每个个探探针针分分子子的的杂杂交交信信号号，进进而而获获取取被被测测样样品品中中D DN NA A 分分子子的的数数量量和和序序列列信信息息。该该技技术术可可用用于于大大规规模模筛筛查查由由基基因因突突变变引引起起的的疾疾病病。检测原理和步骤：检测原理和步骤：（1 1）制作芯片：根据疾病制作芯片：根据疾病基因中的突变位点区域的核基因中的突变位点区域的核苷酸序列，合成苷酸序列，合成2020个核苷酸个核苷酸长的探针，将其固定于芯片长的探针，将其固定于芯片上，芯片上可固定成千上万上，芯片上可固定成千上万个探针。个探针。（2 2）从被测对象的细胞中从被测对象的细胞中提取提取DNADNA，用酶切成较小

12、的，用酶切成较小的片段，对片段，对DNADNA作荧光标记，作荧光标记，并熔解成单链。并熔解成单链。（3 3）将将样样品品滴滴加加到到芯芯片片上上并并与与芯芯片片上上的的探探针针杂杂交交，凡凡是是与与探探针针互互补补的的酶酶切切片片段段会会固固定定于于特特定定位位置置上上，不不能能互互补的片段会被洗脱掉。补的片段会被洗脱掉。（4 4）对对芯芯片片上上的的荧荧光光作作扫扫描和分析。描和分析。Gene screening using a DNA microarray.5.5.遗传咨询的若干伦理问题遗传咨询的若干伦理问题遗遗 传传 病病 的的 定定 义：义：遗传病是由于遗传物遗传病是由于遗传物质发生改

13、变而造成的质发生改变而造成的疾病，它可在上下代疾病，它可在上下代之间按一定的方式垂之间按一定的方式垂直传递，并且在有血直传递，并且在有血缘关系的个体间由于缘关系的个体间由于遗传继承，有一定的遗传继承，有一定的发病比例。发病比例。6.6.遗遗 传传 疾疾 病病 的的 分分 类类1.1.染色体病、染色体病、2.2.单基因遗传病、单基因遗传病、3.3.多基因遗传病多基因遗传病遗传病的发病率有增高趋势遗传病的发病率有增高趋势:19561956年活婴中有先天性缺陷患儿的比例约年活婴中有先天性缺陷患儿的比例约4 4；19681968年活婴中有先天性缺陷患儿的比例约年活婴中有先天性缺陷患儿的比例约6 6；1

14、9771977年活婴中有先天性缺陷患儿的比例约年活婴中有先天性缺陷患儿的比例约10.810.8。遗传病本身具有的严重性遗传病本身具有的严重性:遗传性遗传性(hereditary):(hereditary):患者家庭的上、下垂直发病或同患者家庭的上、下垂直发病或同代间的水平发病，家系中往往有多个发病的个体；代间的水平发病，家系中往往有多个发病的个体；先天性先天性(inborn):(inborn):在胎儿期即存在遗传损害，生后即出在胎儿期即存在遗传损害，生后即出现缺陷，给预防和治疗造成极大的困难；现缺陷，给预防和治疗造成极大的困难；终生性终生性(life long):(life long):患者受

15、累终生直至死亡。患者受累终生直至死亡。（AR）（AD）（XR）7.遗传服务的四大伦理原则遗传服务的四大伦理原则尊尊 重重 自自 主主行行 善善无无 伤伤 害害公公 正正产前诊断中涉及道德问题上的产前诊断中涉及道德问题上的4 4项基项基本准则本准则 尊重夫妇双方的选择尊重夫妇双方的选择 对个人和家庭不产生伤害对个人和家庭不产生伤害 产前诊断的结果可靠产前诊断的结果可靠 产前诊断和遗传咨询自愿性产前诊断和遗传咨询自愿性二、基因治疗二、基因治疗（genetherapy）人人类类的的遗遗传传性性疾疾病病治治疗疗的的常常规规方方法法：（1 1）手手术术治治疗疗，如如先先天天性性心心脏脏病病通通过过手手术

16、术加加以以矫矫正正（2 2）药药物物治治疗疗，如如生生长长激激素素缺乏症（侏儒）可注射人生长激素等。缺乏症（侏儒）可注射人生长激素等。基基因因治治疗疗定定义义：应应用用基基因因工工程程手手段段将将正正常常基基因因导导入入有有缺缺陷陷的的靶靶细细胞胞中中，使使正正常常基基因因表表达达，并并合合成成相相应应的的产产物物，使使细细胞恢复正常的功能，使疾病得到治疗。胞恢复正常的功能，使疾病得到治疗。体细胞基因治疗：体细胞基因治疗：将正常的外源基因导入到患者特定的体将正常的外源基因导入到患者特定的体细胞中，并使其正常表达，合成患者所缺的某种蛋白质或细胞中，并使其正常表达，合成患者所缺的某种蛋白质或酶，使患者的症状得以改善。酶，使患者的症状得以改善。生殖细胞基因治疗：生殖细胞基因治疗：将正常基因导入患者的生殖细胞、受将正常基因导入患者的生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞，使这类细胞中的某些异常基因的功精卵或早期胚胎细胞，使这类细胞中的某些异常基因的功能得以恢复，最终发育成正常个体。能得以恢复，最终发育成正常个体。基因治疗方法和步骤基因治疗方法和步骤 通常将正常的基因首先与基因转移的载体相连接，通常将正