彗星实验.docx

1、彗星实验彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测13，并在统计学基础上对损伤程度做出评估4。本实验对Singh等5建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。用超净工作台上的紫外消毒灯可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围作为DNA损伤的诱导因子79，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。1材料与方法1.1细胞K562细胞，来源

2、于第四军医大学免疫学教研室，37 、5 CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。1.2紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。1.3主要试剂和仪器培养基：10新生牛血清(杭州四季青公司)，90 RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。其余生化试剂均为分析纯。电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM

3、 LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.21.4实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95，用Hanks(pH7.4)调整细胞密度至1105/ml，接种于塑料培养皿中(=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。1.5细胞活性检测台盼蓝拒染法10即时检测经UV处理后K562细胞的活性。1.6彗星实验1988年Singh等5建立了碱性彗星实验

4、，我们对该实验流程进行改良，首先改变了制胶方法，并在裂解后加入水洗的操作步骤，中和完成后再用梯度酒精脱水。具体流程如下：镀膜法制备底胶，将洁净的载玻片在0.2的常熔点琼脂糖中浸没1 min后，置37 孵箱烘烤过夜；实验时将细胞悬液与低熔点琼脂糖(42 )以11的比例在离心管中混匀，立即灌胶(先用盖玻片在已包被的载片上搭一个22 mm10 mm0.17 mm的小槽再灌胶)，4 静置15 min后取下盖片，制得含细胞胶层。裂解，4 ，1 h。水洗，三蒸水4 水洗3 次，5 min/次。解旋，4 ，20 min。电泳，4 ，20 min，0.8 V/cm。中和，3 次，每次5 min。梯度酒精脱水，

5、(50、70、80、90、100、100，常温下各一次，每次5 min)。染色(EB，20 g/ml，20 l),之后镜检，每组随机取50 个细胞，用CASP分析软件进行分析1114。1.7统计学方法实验数据进行t 检验。2结果2.1改良实验方法的结果通过对制胶方法的改进，基本解决了实验中常见的脱胶现象。同时经梯度酒精脱水后的彗星图象基本位于一个焦平面上(图1)，采图更为方便、可靠。2.2台盼蓝染色结果显示紫外线照射没有产生致死性损伤。2.3彗星实验结果由表1可知，UV照射K562细胞从最短的照射时间(3 s，0.9 mJ/cm2)开始，实验组尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩均大于对照组，且

6、差异具有统计学意义 (P0.01)。当UV照射时间延长到240 s时，各参数不再增加。从3 s到180 s，这些检测参数均表现出时间依赖效应。表2的数据显示，实验组彗星头部半径、头部的面积、头部的DNA含量、头部平均荧光强度、头部DNA百分比随照射时间的增加，表现出振荡模式。表3的实验结果显示，UV处理后，实验组细胞核DNA尾部的面积、尾部DNA、尾部DNA百分比均大于对照组，t检验有统计学意义(P0.01)，且随UV照射时间的延长，除尾部平均荧光强度外，其它各参数下实验组表现出增加的趋势，显示出时间依赖效应。3讨论DNA分子中的共轭键可吸收较短波长的紫外线，从而导致自身发生损伤15。彗星实验

7、可以检测DNA链断裂损伤。我们采用改良的彗星实验进行检测，用尾长、彗星长、尾矩，Olive尾矩作为分析指标，结果显示，0.3mW/cm2 UV照射3 s即可造成细胞DNA损伤，且随UV照射时间的增加，DNA损伤也增加，表现出良好的时间效应关系，说明改良的彗星实验方法和上述四种分析指标比较可靠。当照射时间增加到240 s时，各分析指标有下降的趋势，表明彗星实验有检测的阈值，当细胞损伤程度超过此值后，该方法就不能够进行准确的检测。当以尾部的面积、尾部的DNA和尾部的DNA百分比作为分析指标时，结果表现出时间依赖性，提示可以将这些参数用作DNA损伤的分析指标。Durand等16分析了彗星图象的几种指

8、标(尾长，彗星尾部DNA百分比，彗星尾矩)，发现尾矩这一指标具有分析范围广的特点。我们的实验结果与他们的研究有较好的一致性。由于尾矩、Olive尾矩等分析参数可以反映尾部的面积、尾部的DNA含量以及尾部的DNA百分比，因此选择尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩作为彗星实验的分析指标，均能较好反映细胞DNA的损伤程度。而采用彗星头部半径、头部面积、头部DNA含量、头部DNA百分比和头、尾部的平均荧光强度作为分析指标时，损伤程度随UV光强的增加表现出振荡模式，提示这6种分析指标不适合用作彗星实验DNA损伤的评价指标。综上，我们建立的改良彗星实验系统具有较好的可靠性，CASP分析软件可用于彗星实验的

9、分析，彗星长、尾长、尾矩和Olive尾矩，均能较好地反映细胞DNA的损伤程度。由Osting 和Johanson 于1984 年首先提出的微电泳技术,1988 年经Singn 等进一步完善为单细胞凝胶电泳( single cell gel elect rophoresis , SCGE) 。SCGE 是一种在单细胞水平上检测DNA 链损伤的方法,其原理是:包埋在琼脂糖凝胶中的细胞在中性或碱性条件下经裂解与解旋后,带负电荷的DNA 游离断片,在电场作用下向阳极迁移。在荧光显微下观察,受损DNA 形成的影像形似夜空中的彗星,故又称“彗星试验”(Comet Assay) 。彗星试验检测单细胞水平DN

10、A 损伤,无需放射性示踪,适用于各种有核细胞,样品用量少,试验周期短,故而灵敏、快速、简便(1 ,2) 。目前国内外对彗星试验研究的热点主要集中在两个方面:彗星试验的应用与方法学研究。1 彗星试验的应用111 检测化学物质引起的DNA 损伤目前,对化学物质的DNA 损伤作用检测依然是彗星试验的主要应用范围。自彗星试验建立以来,已有多种物质的DNA 损伤作用经过检测,对金属化合物、氧化剂、烷化剂、交联剂的研究都有报道。近年来的研究不仅仅局限在物质是否造成DNA 损伤,在损伤机制、损伤与修复问题上已有了新的探索。M.Tafazoli 等用彗星试验检测了五种氯化烷、烯类物质,结果证明:氯基数目的多少

11、与双键是否存在使物质致DNA 损伤作用存在质和量的差别,含氯数目越多,DNA 损伤作用越强,带双键的烯类比无双键的烷类损伤作用强,说明物质的DNA 损伤作用与其结构密切相关(3) 。Toshio Kasamatsu 将彗星试验改良,使细胞裂解后再染毒,并与传统彗星试验比较,结果发现:所检测的直接致突变物,在改良法和传统法中均得到阳性结果;需要经过代谢或膜作用才能对DNA 造成损伤的间接致突变物则只在传统法中得到阳性结果,在改良法中为阴性,这一研究成果对我们分析遗传毒物的化学与生物特性颇有参考价值(4) 。112 化学物质的靶组织遗传毒性评价B. L. Pool2Zobel 等将从人体组织直肠获

12、得的细胞克隆后,暴露于有致癌危险性的化学物中,观察形成直肠肿瘤的情况,该研究证明彗星试验能有效评估不同化学物质对靶组织的遗传毒性(5) 。体外试验检测出的致突变物质,在机体内经代谢后,对整个机体的作用如何,对哪些组织具有遗传毒性,是否具有特异性靶组织,彗星试验体内试验研究将对其做出客观评价。1. 3 辐射生物学研究过去的研究已证实彗星试验检测低剂量辐射引起的DNA 损伤快速、灵敏。它可以监测接触放射线的人群DNA 损伤状况,监测肿瘤放疗前后DNA 损伤变化,总之,彗星试验已被广泛应用于辐射损伤的监测。1996 年Takajj Ikushima 提出假说:辐射诱发DNA 损伤的有效修复机制的激发

13、与放射适应性有关。他们首先让细胞在37 接受非损伤性低剂量辐射4h ,再以损伤剂量处理适应细胞和未适应细胞,发现适应细胞损伤修复率高。这一发现使我们对辐射生物效应的研究打开了新思路(6) 。1. 4 肿瘤细胞生物学研究1. 4. 1 凋亡与肿瘤:细胞凋亡与肿瘤的关系,是目前毒理学研究的一个崭新方向。肿瘤的产生缘于机体内调节细胞增殖和死亡平衡的机制被破坏。在肿瘤发生发展及灭亡过程中,细胞凋亡起着重要作用,对凋亡的进一步研究将对认识肿瘤的发生机制、预防及治疗肿瘤产生深远的影响(7) 。凋亡发生时将产生180 200bp 或其整数倍大小的DNA 片段,在彗星试验中呈现独特的小头大尾的形态学特征, (

14、8) 因此,以DNA 损伤为检测终点的彗星试验可用于凋亡的检测。1. 4. 2 肿瘤细胞药物抗性: Peggy Olive 等研究发现:肿瘤细胞亚群对DNA 损伤具有抗性(9) 。由于彗星试验检测单细胞水平DNA 损伤,对细胞亚群的损 208 伤情况,各细胞亚群对物质作用的反应是否均一都能得到明确的结果。因此,彗星试验用于检测药物抗性细胞,能够为治疗方案的及时调整提供依据。1. 5 生态毒理学1996 年G. Koppen 等首次将彗星试验应用于植物细胞- 蚕豆根尖细胞,他们将蚕豆根尖细胞以浸泡方式暴露在不同化合物的溶液中,观察DNA 损伤情况,发现甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、丝裂霉素C、氯化镉、

15、重铬酸钾、氯化铬都能诱导蚕豆根尖细胞DNA损伤。彗星试验用于植物系DNA 损伤监测,对于环境质量的评估非常有意义(10) 。1. 6 工业废水监测研究工业废水的遗传毒性最常用的方法是微生物测试系统(Ames 试验) 和植物测试系统(紫母草花粉母细胞和蚕豆根尖细胞微核试验) ,这些试验需对样品进行预处理,操作繁杂。张遵真等将彗星试验改良,直接将细胞浸泡于不同浓度的各种工业废水中检测其DNA 损伤效应,提供了一种敏感性高、可直接测定各种污水遗传毒性的方法(11) 。1. 7 人群流调近年来彗星试验用于流行病学调查增多。Ric2cardo Crebelli 等检测苯职业暴露人群外周血淋巴细胞DNA

16、损伤情况,发现暴露人群与匹配的对照人群相比较,DNA 损伤有显着差异,暴露组尾长远远大于对照组(12) 。E. Rojas 等调查吸烟人群颊粘膜细胞DNA 损伤情况,与不吸烟人群相对比,吸烟者DNA损伤明显高于不吸烟者,其尾长89. 30 16. 18m ,而不吸烟者为52. 01 10. 43m(13) 。Roberto Barale则对戒烟人群进行随访追踪调查,发现成烟一年后,外周血淋巴细胞DNA 损伤明显减少(14) 。彗星试验所需样品用量少、灵敏、快速,必将成为分子流行病学调查的有力手段。1. 8 临床应用1. 8. 1 病因与发病机理分析:未被正确修复的DNA氧化性损伤可以导致疾病甚

17、至癌变, Kleiman NJ 等研究发现:白内障病人的晶体上皮细胞DNA 损伤水平升高,可能是氧化性损伤未被修复所致,故推测白内障发病机理可能与损伤的DNA 未被切除修复有关(15) 。1. 8. 2 疾病诊断; 遗传性疾病如着色性干皮病(XP) ,因缺乏对DNA 损伤的修复能力,对紫外线诱发皮肤癌高度敏感。彗星试验可作为着色性干皮病及其他以切除修复缺陷为特征的综合征的诊断工具,有利于早期发现患者、控制疾病(16) 。1. 813 药效评估:N - acetylcysteine (NAC) 曾被公认具有抗X 一放射作用,而BjornHellman 等用彗星试验研究却发现:无论NAC 存在与否

18、,遭受X - 射线的淋巴细胞DNA 损伤都非常明显并有剂量效应关系,未发现NAC 有抗放射作用,说明NAC 应用范围有限(17) 。依托泊苷etoposide 是一种有效的抗肿瘤药,但研究发现:在损伤肿瘤细胞DNA 的同时,该药对正常的外周血淋巴细胞DNA 也造成损伤,且呈剂量一效应关系。说明彗星试验能帮助我们全面客观地评估药效(18) 。1. 8. 4 临床用药短期和长期遗传毒性评估: P.Gauduchon 等利用彗星试验评价两种抗真菌药对人淋巴细胞DNA 损伤作用,发现暴露于Chlirithalonil中1h ,有明显DNA 损伤而未见细胞死亡,暴露24h则细胞存活率急剧降低,在Carb

19、endazim 中暴露1h和24h 均未见细胞毒性效应和DNA 损伤效应,为人们临床用药提供了参考(18) 。2 彗星试验方法学研究1997 年D. Slamenova 等人选用彗星试验、碱洗脱法和染色体畸变试验同时检测MNN G 诱导哺乳细胞DNA 损伤,发现彗星试验最敏感,低浓度(约0. 1g/ml) 即可检测到DNA 损伤,而另两种试验需浓度1g/ ml 才能检测,彗星试验灵敏性可见一斑(19) 。但影响试验敏感性的因素很多,如何控制这些因素的干扰,使试验灵敏度达到最佳,尚需进一步研究和摸索。211 细胞理论上彗星试验可用于任何有核细胞,实际上并非每种细胞对任何物质的DNA 损伤作用都敏

20、感。马爱国等用彗星试验分析不同种类细胞的DNA 氧化损伤效应及自身修复能力的差异,结果显示淋巴细胞对氧化损伤有较强的抵抗力且损伤修复率低,修复慢(20) 。2. 2 细胞暴露方式细胞暴露于化合物的方式不同,试验敏感性也不同。张遵真等对彗星试验的悬浮染毒与传统染毒方式进行对比研究,发现:采用悬浮染毒检测化合物的DNA 损伤作用比传统染毒更敏感,并具有节省细胞和时间、均匀性好、操作方便等优点(21) 。2. 3 裂解条件包括盐浓度、pH 及裂解时间。对于盐浓度和pH ,结论比较一致,而裂解时间观点却不一。以往的研究认为裂解时间对试验结果影响很大,应在1h 与3h 之间,裂解过长将导致阴性组背景值增

21、加;而1997年Ashbv 等将裂解时间延至18h 亦未见阴性组拖尾形成,他们认为裂解时间对结果无大的影响(22) 。2. 4 解旋及电泳条件包括解旋时间、pH 及NaCl 浓度、电压、电流及电泳时间。我们认为解旋30 分钟、电压2025 伏、电流200300 毫安、电泳30 分钟为宜。其中,解旋时间、pH、电压、电泳时间对试验结果影响最大,其余则较小。Ashbv 等观察到MNN G处理过的细胞解旋0. 3h 与阴性对照组解旋8h 尾长相似,随解旋时间的增加,彗星尾部各参数的值亦增加(22) 。Maria Klaude等研究了电泳pH 的影响,发现:中性条件下,彗星尾主要由环状DNA 组成,附

22、着于核,向四周伸展而不会迁移,碱性条件下游离DNA 断片则向尾部迁移,可见pH 大小对结果有很大的影响(23) 。2. 5 检测指标彗星试验的检测指标主要有拖尾细胞率、尾长、尾矩、DNA 含量。有时仅用尾长就能说明问题,有时用单一的指标并不能详尽地反映试验的真实情况,需要综合考虑。在试验中选择合适的指标,能使试验敏感性增高。3 彗星试验应用前景展望311 致突变物初筛:目前应用最广泛的体外哺乳动物细胞短期致突变试验是姊妹染色单体交换试验(SCE) 和外周血微核试验(peripheral blood micronu2cleus ,pbMN) ,若彗星试验的敏感性能够与上述二者一致或接近,因其简便

23、、快速等特点,决定了其在致突变物初筛中广阔的应用前景。但致突变物质种类繁多,结构不同,功能基团不同,作用方式亦不同,彗星试验是否对各种类型的物质都敏感,还需进行系统的研究。312 生态毒理:将彗星试验应用于植物细胞或者鱼类、贝类,对来自土壤、水体、大气的常见动植物进行监测,对环境污染物的遗传毒性评估、环境质量的监测与评估提供了新的手段。313 分子流行病学监测手段:彗星试验可监测职业暴露人群的DNA 损伤情况,也可监测暴露于某种环境因素中的个体DNA 损伤情况,评价环境因素的潜在危害。单细胞凝胶电泳步骤：1. 分离制备单细胞悬液：（1） 体外培养的细胞株：用胰酶消化，最后用PBS悬浮吹打成单细

24、胞悬液，细胞要计数，具体的量我前边已经说过。2. 胶板制备：（1） 取100l于45水浴中保温的0.5%NMA，铺于磨沙载玻片上，形成底胶。盖玻片推匀，不能有气泡，4度凝固5至8分钟。（2） 水平取下盖片，取100l于37水浴中保温的0.5%LMA与20l细胞悬液（约400个细胞）混匀，立即铺片，加上盖玻片，4度凝固5至8分钟。3. 细胞裂解与电泳：（1） 将制备好的胶板去掉盖玻片后，浸于4预冷的细胞裂解液中，在4下裂解2.5到3小时。（2） 取出胶板，用双蒸水浸没漂洗后放入电泳槽中，浸泡在4预冷的电泳液中解旋20分钟。（3） 玻片水平放置阳极端附近，4电泳20到25分钟（25V，300mA）

25、。可在电泳槽周围加冰块以保持低温。4. 中和与染色：（1） 电泳结束，将胶板浸泡于中和液中，每次10分钟，共中和3次，每次要更换中和液。最后晾干。（2） 取出胶板，置于染色缸中，在2g/ml的EB染色液中，暗处染色5到10分钟。（3） 蒸馏水漂洗2次，每次5分钟。稍晾干，滤纸吸去多余水分，尽快在荧光显微镜下观察。从胶板制备开始到最后都应该在暗光下操作。具体的你可以查写文章，好好看看下面连接的那些讨论内容试剂及材料：1）PBS2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）3）0.6低熔点凝胶（PBS配制）4）毛玻璃片5）盖玻片6）碱性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA

26、;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠），临用前加10DNMSO，1Triton X-1007）电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH7.5）8）EB（2ug/ml）步骤：1.制备第一层胶：100ml 0.8正常熔点胶，加盖盖玻片，4固化10min；2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含110000个细胞的0.6低熔点胶（cell与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4固化10min；3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10 DMAO，1Triton X-100），4裂解1h；4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。5.电泳：电压20V，300mA，30min6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min；7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。或者4，潮湿，闭光的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。