水飞蓟素总结报告.docx

1、水飞蓟素总结报告水飞蓟素总结报告江苏省科技计划项目验收报告项 目 名 称：水溶性水飞蓟素提取加工技术研究及产品开发项 目 编 号：BE2006321 项目负责人：何尔群 承 担 单 位：江苏健佳药业有限公司 起 止 年 限：2006年1月2008年12月 一、原计划合同内容二、项目实施工作总结报告（包括技术总结）1水溶性水飞蓟素提取工艺研究2水溶性水飞蓟素提取与加工技术路线3水溶性水飞蓟素化学成分的分析4水溶性水飞蓟素产品质量标准的研究与制定三、技术成果1研究论文发表情况2专利申请情况3技术特点四、经费使用情况五、附件一、原计划合同内容1、主要研究内容本项目是从水飞蓟籽中提取水溶性水飞蓟素。通

2、过对原料的预处理、水溶性水飞蓟素的提取、包合技术、澄清、分离、浓缩、干燥等过程的研究与改进，确定水溶性水飞蓟素的提取工艺条件，明确该产品的含量指标及一般理化指标，并完成中试，使水溶性水飞蓟素产品达到工业化生产水平。制定水溶性水飞蓟素的质量标准，填补国内这一领域的空白。2、主要技术指标(1) 确定水溶性水飞蓟素提取工艺条件，完成中试，达到工业化生产水平；(2) 制定水溶性水飞蓟素的质量标准；(3) 发表论文23篇。3、参加人员项目承担单位：江苏健佳药业有限公司项目参加单位：江苏省中科院植物研究所项目负责人：何尔群姓 名性别年龄职称/职务从事专业为本项目工作时间（%）所在单位何尔群男56高级工程师

3、药 学80江苏健佳药业有限公司李维林男40研究员药 学30江苏省中科院植物研究所主要研究人员周志清男51经济师经济管理30江苏健佳药业有限公司徐伯衡男42高级工程师药 化60江苏健佳药业有限公司吴振祥男54主任药师药 化60江苏健佳药业有限公司任冰如女42研究员植物化学40江苏省中国科学院植物研究所梁呈元男34助理研究员植物资源60江苏省中国科学院植物研究所4、经费预算1). 经费来源预算单位：万元合计2006年2007年2008年备注合计2009060501、省拨款25252、部门、地方配套3、承担单位自筹1756560504、银行贷款5、其他来源2). 项目经费支出预算单位：万元预算数占预

4、算支出总额的比重(%)备注合计2001、人员费31.52、设备费90453、能源材料费88444、试验外协费52.55、差旅费216、会议费217、管理费52.58、基建费2.02.09、其他相关费用10、测试及试验费52.5二、项目工作总结（包括技术总结）1、水溶性水飞蓟素提取工艺研究(1) 原料的预处理水飞蓟种子榨油。水飞蓟油可以制作色拉油具有色清、味纯、沸点低、易被人体吸收等特点，有保肝养胃功能，无任何毒副作用，是一种高级保健食用油。榨油后的水飞蓟饼用于提取水溶性水飞蓟素。提取水溶性水飞蓟素后渣饼富含淀粉、蛋白质，因不含任何有机溶剂，经适当加工后即能形成营养成份较高的天然饲料，是养禽、养

5、猪、喂养水产品的极佳饲料。(2) 水溶性水飞蓟素的提取采用碱水的醇溶液为溶剂，以水溶性水飞蓟素的得率和水飞蓟宾含量为工艺考察指标，以提取时间、提取温度、溶剂用量、pH值为实验因子，通过单因素试验和正交试验，研究并优选出了水溶性水飞蓟素的最佳提取工艺条件。材料与仪器水飞蓟种子采自于江苏东台本公司种植基地，由江苏省中国科学院植物研究所李维林研究员鉴定为菊科植物水飞蓟 (紫花) ( Silybum marianum (L.) Gaertn) 的种子。Mettler AE240 电子天平，KQ-100DE型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司），北京普析通用TU-1901紫外-可见分光光度计，Shima

6、dzu高效液相色谱仪（LC-20A泵，SPD-20A紫外检测器）等。水飞蓟宾标准品（含量99.5，HPLC纯，中国药品生物制品检定所），其余试剂均为分析纯。方法与结果水溶性水飞蓟素提取工艺的单因素试验1). pH值对水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量的影响分别称取水飞蓟饼500g，分别加入不同pH值的30%的碱乙醇1500ml，于80提取3遍，合并滤液，浓缩成到流膏，体积在500ml时，加入40g 101澄清剂，搅匀，静置1h后，分离上清液，浓缩真空干燥，得粗品，再加入20倍体积纯化水，充分溶解，离心分离上清液，真空浓缩得成品。称取成品重量，计算得率。另取成品50mg，精密称定，置100ml量瓶

7、中，加甲醇适量，水浴加热使溶解，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取对照品溶液和供试品溶液各5ml，分别置25ml量瓶中，分别精密加2，4-二硝基苯肼溶液（取2，4-二硝基苯肼0.5g，置50ml量瓶中，加硫酸1ml使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀）2ml，置50-55水浴中反应50分钟，冷却，加氢氧化钾-甲醇溶液（取氢氧化钾10g，置100ml量瓶中，加水30ml使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀）稀释至刻度，摇匀，离心10分钟，精密量取上清液5ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，照分光光度法（中国药典2005年版地附录），在490nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得水飞蓟素

8、含量。另取本品0.11g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取经60减压干燥3小时的水飞蓟宾对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。精密吸取上述两种溶液各5l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以水飞蓟宾与异水飞蓟峰面积之和计算。试验结果如下图所示。由图可以看出，随着碱水pH值的下降，水飞蓟素和水飞蓟宾的含量明显上升，可能是由于pH太高会破坏黄酮母核，导致含量下降，故碱水提取的pH采用在8-8.5为宜。2). 提取温度对水溶性水飞蓟素得率和

9、水飞蓟宾含量的影响分别称取水飞蓟饼500g，加入pH值为8的30%的碱乙醇1500ml，于90、80和70各提取3遍，合并滤液，浓缩成到流膏，体积在500ml时，加入40g 101澄清剂，搅匀，静置1h后，分离上清液，浓缩真空干燥，得粗品，再加入20倍体积纯化水，充分溶解，离心分离上清液，真空浓缩得成品。同1)法分别测定水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量。试验结果如下图所示。由图中可以看出，随着温度的降低，水飞蓟素和水飞蓟宾含量在80达到最高，且此时水和乙醇的公沸点接近，故采用提取温度在80为宜。提取水溶性水飞蓟素的正交试验在前期经验的基础上，选择碱水的乙醇液为溶剂，以乙醇用量、乙醇浓度、提取时

10、间为实验因素，每个因素设3个水平，进行L9(34)正交实验。正交实验的因素和水平水平因素溶剂用量（倍）A乙醇浓度（%）B提取时间（h）C16+6+4401.0+1.0+1.028+8+6351.5+1.5+1.5310+10+8302.0+2.0+2.0取榨油后的水飞蓟饼，分别精密称取9份，各500.00g。按表选择的条件分别加入pH8的碱水的乙醇液，于80提取3遍，合并滤液，浓缩成流膏，体积在500ml时，加入40g 101澄清剂，搅匀，静置1h后，分离上清液，浓缩真空干燥，得粗品，再加入20倍体积纯化水，充分溶解，离心分离上清液，真空浓缩得成品。加热回流提取，合并提取液，过滤，浓缩，回收乙

11、醇，水浴（60）蒸至近干，再于真空干燥箱中（60）干燥，干燥器中冷却0.5h后迅速称重，粉碎成粉末。水飞蓟宾的含量测定方法（HPLC法）及水飞蓟素的含量测定方法（UV法）同上1)法。对照品溶液的配制和标准曲线的建立精密称取水飞蓟宾标准品适量，以甲醇溶解并配制成含水飞蓟宾浓度为0.216 mgml-1的溶液。取对照品溶液10，12，14，16，18，20l，分别进样，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。Y=4.30664105X+ 2.9658104，r=0.9999。结果表明水飞蓟宾在2.164.32g内线性关系良好。数据处理

12、及结果对正交实验结果采用综合评价方法，即以水飞蓟宾的含量加权系数0.6、水溶性水飞蓟素成品得率加权系数0.4作为综合评价指标。综合评价分值=水飞蓟宾含量0.6+水飞蓟素0.4，结果下表。方差分析结果见表，表明乙醇浓度、提取时间对实验结果有显著影响，其中乙醇浓度（B）影响最大，其次是提取时间（C），溶剂用量（A）影响较小。由表2直观分析综合评价R值，最佳提取工艺是A3B2C2，即30%乙醇提取三次，每次提取2h，前两次加8倍量乙醇，第三次加6倍量乙醇。以最佳工艺进行验证实验，结果表明该工艺重复性和稳定性好，适于大生产。正交实验结果实验号影响因素水飞蓟宾(%)水飞蓟素(%)综合评价ABCD1111

13、19.2119.613.366212228.8921.714.014313339.4520.813.9904212310.2322.615.1785223110.3423.815.7246231211.2825.216.8487313210.6724.316.1228321312.0925.917.6149332111.7625.617.296K110.895 10.780 10.829 11.047K211.987 11.372 10.190 11.043K311.194 12.924 11.054 10.984R0.299 0.592 0.362 0.063方差分析方差来源SSfSFP溶剂

14、用量A0.14045420.0702317.70080.05乙醇浓度B0.57141420.2857172.01280.05提取时间C 0.2007820.1003925.303599.5，HPLC纯，中国药品生物制品检定所）；水溶性水飞蓟素产品由本公司自制，批号为20070921、20071108、20071209。岛津LC-10A高效液相色谱仪；日本岛津SPD-10A检测器；浙江大学N2000色谱工作站；METTLER AE240电子天平。甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。方法与结果色谱条件色谱柱AichromBond-C18(5m，4.6 250 mm)；以甲醇-水-冰醋酸（

15、50：50：0.5）为流动相，检测波长为288nm，理论板数按水飞蓟峰计算应不低于5000。对照品溶液的制备精密称取经60减压干燥3小时的水飞蓟宾对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg水飞蓟宾的溶液，作为对照溶液。 供试品溶液的配制取本品0.11g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。线性关系考察取对照品溶液2、4、6、8、10l，分别进样，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程得水飞蓟宾：Y=871.66X-0.

16、4488，r=0.9999。结果表明水飞蓟宾含量在0.0200.100g内线性关系良好。精密度实验取对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，每次5L，水飞蓟宾的峰面积RSD为1.09%，说明该方法精密度良好。重复性试验取水溶性水飞蓟素产品（批号20070921）共6份，分别前述样品溶液制备方法和色谱条件操作，计算含量。结果显示水飞蓟宾的平均含量为11.129%，RSD=1.1%，说明该方法有良好的重复性。加样回收率测定准确称取水溶性水飞蓟素产品（批号20070921，其中水飞蓟宾含量为11.129%）5份，每份 10.0mg，分别精密加入水飞蓟宾对照品溶液25ml（浓度为0.010032mg

17、ml-1），精密加入甲醇至50ml, 按前述样品溶液制备方法及色谱条件和测定方法，进行含量测定。结果显示水飞蓟宾平均回收率为97.28%，RSD=1.0%，说明该法回收率良好。样品分析精密称取各批次样品各3份，按前述样品溶液制备方法及色谱条件和测定方法，测定水飞蓟素含量，用外标法，根据峰面积计算含量，结果其含量分别为11.364%，10.865%，11.250%。结论与讨论在本实验所确定的条件下，水溶性水飞蓟素产品中的主要成分水飞蓟宾能很好地分离，且重现性、精密度较好，可以作为水溶性水飞蓟素的质量控制方法。（2）水溶性水飞蓟素产品质量标准的制定根据以上研究结果，制定水溶性水飞蓟素产品质量标准如

18、下：水溶性水飞蓟素质量标准本品为菊科植物水飞蓟 (Silybum Marianum (L.) Gaertn)的果实，经提取所得的松散粉末，按干燥品计含水飞蓟素以水飞蓟宾计算 (C25H22O10) 不得少于25.0%，含水飞蓟宾和异水飞蓟宾不得少于10.0%。性状本品为淡黄色至浅棕色的松散粉末，在水中溶解。鉴别取本品0.1克，加甲醇10ml，振摇，滤过，取滤液，照下述方法试验。(1) 取滤液1ml，加锌粉少许及盐酸数滴，即显玫瑰红色。(2) 取滤液2ml，加醋酸铅试液1ml，即产生黄色沉淀。(3) 取滤液适量，用甲醇稀释制成每1ml中约含16ug的溶液，照分光光度法 (中国药典2005年版二部

19、附录 ) 测定，在288 nm的波长处有最大吸收。检查溶解性 取本品1克，加纯化水200ml振摇溶解，应澄清。干燥失重取本品，在70减压干燥3小时，减失的重量不得超过5.0%（中国药典2005年版二部附录）炽灼残渣不得过0.5%（中国药典2005年版二部附录 ）重金属取炽灼残渣项下遗留的残渣，依法检查（中国药典2005年版二部附录 第二法），含重金属不得过20ppm。含量测定 水飞蓟素（总黄酮）对照品溶液的制备取水飞蓟宾对照品约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量，水浴加热使溶解，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。供试品溶液的制备取本品50mg，精密称定，置100ml量瓶中

20、，加甲醇适量，水浴加热使溶解，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。测定法精密量取对照品溶液和供试品溶液各5ml，分别置25ml量瓶中，分别精密加2，4-二硝基苯肼溶液（取2，4-二硝基苯肼0.5g，置50ml量瓶中，加硫酸1ml使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀）2ml，置50-55水浴中反应50分钟，冷却，加氢氧化钾-甲醇溶液（取氢氧化钾10g，置100ml量瓶中，加水30ml使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀）稀释至刻度，摇匀，离心10分钟，精密量取上清液5ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，照分光光度法（中国药典2005年版地附录），在490nm的波长处分别测定吸收度，计算，即

21、得。水飞蓟宾 照高效液相色谱法（2005年版二部附录V D）测定。色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸（50：50：0.5）为流动相，检测波长为288nm，理论板数按水飞蓟峰计算应不低于5000。测定法 取本品0.11g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取经60减压干燥3小时的水飞蓟宾对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg水飞蓟宾的溶液，作为对照品溶液。精密吸取上述两种溶液各5l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以水飞

22、蓟宾与异水飞蓟宾峰面积之和计算。类别肝病辅助用药。贮藏遮光，密闭，在阴凉处保存。制剂针剂，冲剂。有效期2年。三、技术成果1、研究论文发表情况(1) Yong-ping Pei, Jian Chen, Wei-lin Li, et al. Progress in Research and Application of Silymarin. Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology, in press(2) 陈剑，李维林，任冰如等. 水溶性水飞蓟素提取工艺的改进与探讨. 植物资源与环境学报，已接收2、专利申请情况 专利申请号200710106033.43、技术特点（1）目前国内普遍的水溶性水飞蓟素提取方法是加入葡甲胺，让水飞蓟素和葡甲胺进行化学合成所得，产品虽然溶于水，但副作用较大，对人体肾功能有阻碍作用，在国际上不能被客户接受。本项目研究利用了黄酮类物质在碱水中溶解的特性，再在无有机溶剂的条件下及时包合，保证黄酮在后道工