总RNA的提取和RT-PCR.ppt

1、总总RNA的提取、定量与的提取、定量与RT-PCR南方医科大学南方医科大学南方医科大学南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心pp完整完整完整完整RNARNA的提取和纯化的提取和纯化的提取和纯化的提取和纯化,是进行是进行是进行是进行RNARNA 方面的研究工作如方面的研究工作如方面的研究工作如方面的研究工作如NothernNothern杂交杂交杂交杂交、mRNAmRNA分离分离分离分离、RT-PCRRT-PCR、定量定量定量定量PCRPCR、cDNAcDNA合成合成合成合成及体外翻译等的前提。及

2、体外翻译等的前提。及体外翻译等的前提。及体外翻译等的前提。pp掌握从细胞中提取总掌握从细胞中提取总掌握从细胞中提取总掌握从细胞中提取总RNARNA的方法的方法的方法的方法pp熟悉紫外吸收法检测熟悉紫外吸收法检测熟悉紫外吸收法检测熟悉紫外吸收法检测RNARNA浓度与纯度的原理及测定方法浓度与纯度的原理及测定方法浓度与纯度的原理及测定方法浓度与纯度的原理及测定方法pp掌握掌握掌握掌握RT-PCRRT-PCR基因扩增的原理和过程基因扩增的原理和过程基因扩增的原理和过程基因扩增的原理和过程目目的的实实验验流流程程提取原理提取原理提取原理提取原理操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤逆转录原理逆转录原理逆转录

3、原理逆转录原理操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤提提提提 取取取取总总总总RNARNA定定定定 量量量量合成合成合成合成cDNAcDNA第一链第一链第一链第一链原理体系原理体系原理体系原理体系引物选择引物选择引物选择引物选择PCRPCR电泳原理电泳原理电泳原理电泳原理电泳步骤电泳步骤电泳步骤电泳步骤电电电电 泳泳泳泳计算方法计算方法计算方法计算方法操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤第一部分第一部分细胞总细胞总RNA的提取及定量的提取及定量原原理理pp1010-5-5 g RNA/g RNA/细细胞胞胞胞 ppmRNA3mRNA3端存在端存在端存在端存在20-25020-250个多聚腺苷酸个多聚腺苷

4、酸个多聚腺苷酸个多聚腺苷酸(polyApolyA)结构，可结构，可结构，可结构，可用用用用oligo(dToligo(dT)亲和层析柱分离亲和层析柱分离亲和层析柱分离亲和层析柱分离mRNAmRNA。ppRNARNA分离的方法分离的方法分离的方法分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍酸胍酸胍酸胍-有机溶剂法，氯化锂有机溶剂法，氯化锂有机溶剂法，氯化锂有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶尿素法，蛋白酶尿素法，蛋白酶尿素法，蛋白酶K-K-细胞质细胞质细胞质细胞质RNARNA提取法等、提取法等、提取法

5、等、提取法等、异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍-酚酚酚酚-氯仿一步法等氯仿一步法等氯仿一步法等氯仿一步法等。pp目前常用的是目前常用的是目前常用的是目前常用的是TrizolTrizol法法法法。rRNA80-85%rRNA80-85%：28S18S5S28S18S5StRNA,snRNA10-15%tRNA,snRNA10-15%mRNA1-5%mRNA1-5%Trizol的主要成分的主要成分ppTrizolTrizol 是一种新型总是一种新型总是一种新型总是一种新型总 RNARNA抽提试剂抽提试剂抽提试剂抽提试剂pp主要成分是主要成分是主要成分是主要成分是异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸

6、胍异硫氰酸胍和和和和酚酚酚酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是。异硫氰酸胍属于解偶剂，是。异硫氰酸胍属于解偶剂，是。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白裂解细胞，使细胞中的蛋白裂解细胞，使细胞中的蛋白裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。核酸物质解聚得到释放。核酸物质解聚得到释放。核酸物质解聚得到释放。pp酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完

7、全抑制酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNARNA酶酶酶酶活性，因此活性，因此活性，因此活性，因此TrizolTrizol中还加入了中还加入了中还加入了中还加入了8-8-羟基喹啉、羟基喹啉、羟基喹啉、羟基喹啉、-巯基乙醇等巯基乙醇等巯基乙醇等巯基乙醇等来抑制内源和外源来抑制内源和外源来抑制内源和外源来抑制内源和外源RNaseRNase。pp在加入在加入在加入在加入氯仿氯仿氯仿氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，离心后，溶液分为水相和有机相，离心后，溶液分为水相和有机相，离心后，溶液分为水相和有机相，RNARNA在在在在上层水相中。上层水相中。上

8、层水相中。上层水相中。pp取出水相用取出水相用取出水相用取出水相用异丙醇沉淀异丙醇沉淀异丙醇沉淀异丙醇沉淀可回收可回收可回收可回收RNARNA；用乙醇沉淀中间；用乙醇沉淀中间；用乙醇沉淀中间；用乙醇沉淀中间层可回收层可回收层可回收层可回收DNADNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。原原理理所有所有所有所有RNARNA的提取过程中都有五个关键点：的提取过程中都有五个关键点：的提取过程中都有五个关键点：的提取过程中都有五个关键点：1.1.样品细胞或组织的有效破碎；样品细胞或组织的有效破碎；样品细

9、胞或组织的有效破碎；样品细胞或组织的有效破碎；2.2.有效地使核蛋白复合体变性；有效地使核蛋白复合体变性；有效地使核蛋白复合体变性；有效地使核蛋白复合体变性；3.3.对内源对内源对内源对内源RNARNA酶的有效抑制酶的有效抑制酶的有效抑制酶的有效抑制；4.4.有效地将有效地将有效地将有效地将RNARNA从从从从DNADNA和蛋白混合物中分离；和蛋白混合物中分离；和蛋白混合物中分离；和蛋白混合物中分离；5.5.对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除

10、去。关关 键键 点点RNARNA酶污染来源酶污染来源ppRNARNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。等。等。等。pp严格控制外源性严格控制外源性严格控制外源性严格控制外源性RNARNA酶的污染酶的污染酶的污染酶的污染：外源性的：外源性的：外源性的：外源性的RNARNA酶存在于酶存在于酶存在于酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器操作人员

11、的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。种试剂的污染。种试剂的污染。种试剂的污染。pp最大限度地抑制内源性的最大限度地抑制内源性的最大限度地抑制内源性的最大限度地抑制内源性的RNARNA酶酶酶酶：而各种组织和细胞中：而各种组织和细胞中：而各种组织和细胞中：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的则含有大量内源性的则含有大量内源性的则含有大量内源性的RNARNA酶。酶。酶。酶。防止防止RNARNA

12、酶污染的措施酶污染的措施 1.1.所有的玻璃器皿均应在使用前于所有的玻璃器皿均应在使用前于所有的玻璃器皿均应在使用前于所有的玻璃器皿均应在使用前于180180的高温下干烤的高温下干烤的高温下干烤的高温下干烤6h6h或更长时间。或更长时间。或更长时间。或更长时间。2.2.塑料器皿可用塑料器皿可用塑料器皿可用塑料器皿可用0.1%DEPC0.1%DEPC水浸泡水浸泡水浸泡水浸泡12h12h以上，高压灭菌。以上，高压灭菌。以上，高压灭菌。以上，高压灭菌。3.3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸有机玻璃的电泳

13、槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在泡在泡在泡在3%H2O23%H2O2室温室温室温室温10min10min，然后用，然后用，然后用，然后用0.1%DEPC0.1%DEPC水冲洗，晾干。水冲洗，晾干。水冲洗，晾干。水冲洗，晾干。4.4.配制的溶液应尽可能用配制的溶液应尽可能用配制的溶液应尽可能用配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC0.1%DEPC在在在在3737处理处理处理处理12h12h以上。然后用高压灭菌除以上。然后用高压灭菌除以上。然后用高压灭菌除以上。然后用高压灭菌除去残留的去残留的去残留的去残留的DEP

14、CDEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用。不能高压灭菌的试剂，应当用。不能高压灭菌的试剂，应当用。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPCDEPC处理过的无菌双蒸水处理过的无菌双蒸水处理过的无菌双蒸水处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。配制，然后经滤膜过滤除菌。配制，然后经滤膜过滤除菌。配制，然后经滤膜过滤除菌。5.5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换实验过程中手套要勤换实验过程中手套要勤换实验过程中手套要勤换。6.6.设置设置设置设置RNARNA操作专用实验室，所有器械

15、等应为专用。操作专用实验室，所有器械等应为专用。操作专用实验室，所有器械等应为专用。操作专用实验室，所有器械等应为专用。加加样样枪枪的的使使用用操作操作步骤步骤 样品处理样品处理样品处理样品处理pp提取组织提取组织提取组织提取组织RNARNA时，每时，每时，每时，每5050100mg100mg组织用组织用组织用组织用1ml1mlTrizolTrizol试剂对组织进行试剂对组织进行试剂对组织进行试剂对组织进行裂解；裂解；裂解；裂解；pp悬浮细胞先离心沉淀，每悬浮细胞先离心沉淀，每悬浮细胞先离心沉淀，每悬浮细胞先离心沉淀，每5-10105-10106 6个细胞加个细胞加个细胞加个细胞加1ml1ml

16、TrizolTrizol后，反复用后，反复用后，反复用后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。pp培养贴壁细胞不须消化，可直接用培养贴壁细胞不须消化，可直接用培养贴壁细胞不须消化，可直接用培养贴壁细胞不须消化，可直接用TrizolTrizol进行消化、裂解，进行消化、裂解，进行消化、裂解，进行消化、裂解，TrizolTrizol体体体体积按积按积按积按10cm10cm2 2/ml/ml比例加入。比例加入。比例加入。比例加入。(注意：注意：注意：注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量匀浆一定要彻底，是提取高质量匀浆一定要彻底，是提取高质量匀浆一定要彻底，是提取高质量RNARNA的前提的前提的前提的前提；细胞数量与；细胞数量与；细胞数量与；细胞数量与TrizolTrizol的比例，细胞的数量不能过多。的比例，细胞的数量不能过多。的比例，细胞的数量不能过多。的比例，细胞的数量不能过多。)实验材料实验材料实验材料实验材料：HEK293HEK293人胚肾细胞人胚肾细胞人胚肾细胞人胚肾细胞 操作步骤操作步骤1.1.细胞中