DNA计算中荧光技术的应用及其发展.docx

1、DNA盘算中荧光技能的应用及其生长张成 杨静 王淑栋 (北京大学信息科学技能学院，高可信度软件技能教诲部重点实验室，北京 100871)摘要：DNA盘算作为前沿科学研究的重点和热点，已经从简朴生长为庞大，从理论转化为应用。在这一历程中，反响速度快，变革灵敏的荧光标志技能发挥了重要的作用。本文围绕DNA盘算和荧光标志技能两个方面进行说明。一方面，对近年来DNA盘算中荧光技能的应用进行了总结：（1）荧光标志的外貌盘算。（2）与某些酶切技能相结合的荧光检测。（3）与DNA链置换相结合的荧光技能。（4）与基因缄默沉静技能相结合的荧光DNA逻辑门。（5）与DNA自组装立体结构相结合的荧光技能。（6）与D

2、NA变构相结合的荧光技能。另一方面，介绍了几种近年来生长起来的新型荧光技能：（1）荧光信号识别放大技能。（2）与磁珠技能相结合的荧光技能。（3）与PH值变革相结合的DNA荧光技能。（4）与miRNAs检测相结合的荧光技能。在今后的研究中，只有将这两者紧密结合，才气发挥DNA盘算天然的优势。要害词：DNA盘算；荧光标志技能；纳米技能；DNA分子；杂交 1 引言DNA由于其具有的特性，在大自然的进化中，被选择为稳定的遗传物质。在细胞中，DNA精细地编码并控制着整个细胞的新陈代谢。另一方面，DNA分子容易组成二级甚至三级结构。因此，DNA作为盘算东西有着得天独厚的优势1,2。近年来，DNA盘算领域生

3、长迅速，尤其在DNA分子自组装、DNA纳米装置等方面3。然而陪同着DNA盘算解决问题的范围增大和形式多样化，求解历程中DNA分子数量急剧增加以及DNA分子结构庞大性的加大，求解历程中实验历程繁琐且存在误差，使得DNA盘算中解的标志和检测变得越发困难4。为了解决这一难题，荧光技能在DNA盘算中逐渐得到了遍及的应用。荧光是指某些物质受到某种波长的光引发后，其原子中的电子被引发到较高能级，产生的发射光。荧光物质分子都具有刚性结构和共平面的-共轭体系。在引发态时，这种结构具有稳定性，可以连续数秒钟，从而有利于能量的转移5。DNA荧光技能在生物学领域中已经有许多应用，如近年来生长起来的DNA荧光标志、r

4、eal-time检测技能、分子信标技能等。荧光标志DNA简朴便捷，可以实时检测，并且灵敏度非常高，这些特点都使得其在DNA盘算中具有遍及的应用前景。目前，结合荧光技能的DNA盘算已经成为前沿研究热点。荧光技能在DNA盘算中的应用主要有如下几类：（1）荧光标志的外貌盘算：通过DNA牢固化和杂交技能，在固相外貌通过荧光标志进行盘算。（2）与某些酶切技能相结合的荧光检测：利用特定酶与DNA分子的特性，通过检测酶切后荧光量进行盘算。（3）与DNA链置换相结合的荧光技能：巧妙利用DNA分子的三链甚至多链结构，通过参加引发链，来释放另一DNA链。（4）与基因缄默沉静技能相结合的荧光DNA逻辑门：利用RNA

5、i技能控制表达荧光卵白，从而构建了多重逻辑门。（5）与DNA自组装立体结构相结合的荧光技能：在DNA自组装结构的底子上，结合了荧光标志技能。（6）与DNA变构相结合的荧光技能：通过DNA分子的差别状态，构建了可控的荧光纳米装置。近年来，荧光技能不但应用于生物学自己，并且在DNA盘算、信息学等诸多领域具有很大的应用潜力。下面有几种近年来生长起来的新型荧光技能：（1）荧光信号识别放大技能。（2）与磁珠技能相结合的荧光技能。（3）与PH值变革相结合的DNA荧光技能。（4）与miRNAs检测相结合的荧光技能。相信随着DNA盘算和荧光技能的生长，这两者必将紧密结合，使得DNA盘算的种类和要领越发多样和成

6、熟。2 DNA盘算中荧光技能的应用2.1荧光标志的外貌盘算DNA外貌盘算其根本原理是：通过DNA牢固化和杂交技能，将代表所有可能存在解的差别DNA序列牢固在固相外貌，然后通过多次的杂交以及降解历程来筛选正解。通过荧光标志可以检测每次和最终盘算的结果。2002年，Adleman组使用杂交池完成了一个20个变量的3可满足性问题6。2004年XingPing Su等在2000年Liu7的事情底子上，设计了一种通用型的DNA外貌盘算模型8。同年，Kristiane A. Schmidt等利用单分子杂交荧光标志技能4个变量的可满足性问题9。下面以2000年，Liu 等颁发在nature上的DNA外貌盘算

7、经典实验为例，说明其解决SAT问题的历程7。由于该问题共有16种可能性，故将代表着差别可能解的DNA片段牢固在固相外貌。在每一次的杂交筛选历程中，参加与牢固DNA链特异性互补的DNA。那末，被杂交的牢固DNA链变为双链，而未互补的单链DNA则被核酸外切酶降解。通过数次操纵，存在于固相外貌的DNA链就是每次经杂交而保存下来的DNA链，也就是代表正解的DNA链。该实验中，荧光技能主要应用在解检测的历程中：使用一条生物素标志的引物和另一条荧光标志的引物，以固相外貌所有可能解的DNA片段为模版，进行PCR。利用磁珠将PCR双链产物吸附，再分散双链，分散出荧光标志的ssDNA。将这些ssDNA与经过多次

8、杂交筛选的固相杂交，只有哪些存留在固相外貌的DNA链可以杂交上，于是特定的位置就可以检测到较高荧光强度。 图1-1 实验示意图 图1-2 列阵荧光检测结果2.2 与某些酶切技能相结合的荧光检测利用酶与DNA分子的特性，通过检测酶切后荧光量进行盘算。其实就是利用某些酶与DNA分子空间结构的相互作用，再结合荧光技能来配合实现的。这种要领具有灵敏度高，反响速度快等特点。其最大的优点就是巧妙地将酶的生物特性与盘算问题相结合，极大地富厚了DNA盘算的手段。2001年，Wang等在上述外貌盘算实验的底子上对解的检测又进行了新的革新，即将酶切和荧光技能相结合10。通过上述核酸外切酶的要领，利用新技能完成单链

9、DNA的解的检测。其根本思想如下：左侧DNA探针的3端至少和右侧杂交的DNA探针有一个碱基的重合，并使得右侧探针有5端呈单链状态。此时右侧探针由两部门组成：一部门是和目标序列形成双链的；另一部门则是由非互补的5端DNA链组成（见图2A）。此时该非互补的5端DNA臂会笼罩在上游寡核苷酸链上，与左侧探针至少有一个重合的碱基。恰恰在这重合的位置，可以形成酶切位点。因此，非互补的5端DNA臂可以被切割而释放。利用这一原理，结合荧光技能，如图所示，将荧光基标志在非互补DNA链的5端，而将荧光淬灭基标志在重合的酶切位点3端偏向（见图2B）。这样，只要酶切位点被酶切，标志有荧光基的非互补的5端DNA链就会被

10、释放，从而与荧光淬灭基分散，使得荧光释放量大大提高。这种要领可以有效检测目的片断是否存在。文中还将PCR要领检测目的片断与这种荧光检测法进行了比拟，发明该要领比PCR检测具有更高的灵敏度。图2 实验原理示意图 图3 几种逻辑门的组成示意图Milan N.等2003年研制了一种名为MAYA的游戏。这是一种利用特殊的DNA酶E6（一种依赖于DNA的RNA酶）构建起来的逻辑门11。这种酶识别的DNA底物要求具有特殊结构（如3a图所示）。只有当上部寡核苷酸探针与E6的支架区互补，上部寡核苷酸才气被切断释放。将寡核苷酸两端分别标志荧光淬灭基（如罗丹明）和荧光基，那末只有寡核苷酸探针被切断释放，荧光基才气

11、有效激活并释放荧光。这是MAYA游戏进行逻辑判断的主要检测手段。构建有效的空间位阻是实现这个检测手段的要害。当寡核苷酸探针的结合使绿色标志的位阻消失的时候，加快酶切反响；当寡核苷酸探针的结合使赤色标志的位阻消失的时候，低落酶切反响。基于以上原理，构建出以下几种逻辑门：YES型、NOT型、AND型和AND-AND-NOT型。YES型逻辑门（图3b所示），当i1寡核苷酸参加时，消除原来i1环状结构，从而标志的荧光探针可以与之结合，并且被切除释放。其判断过称为参加i1，荧光输出。NOT型逻辑门（图c所示）。当参加i6时，环状结构打开，荧光结合的寡核苷酸探针无法结合在互补区域，于是无荧光输出。其判断历

12、程为参加i6，荧光输出停止。AND型逻辑门（图d所示）实际上是将两个YES型逻辑门组装在一起。也就是说，只有当i1和i6都被参加时，才气有荧光输出。AND-AND-NOT型逻辑门（图e）是更为庞大的组合体。必须同时参加i1和i3，才气输出荧光。然而，只要有i6存在，就不会输出荧光。文中解决的问题是在33的棋盘中完成3个棋子同线相连。考察所有的逻辑情况后，将所有可能的逻辑门都提前置于棋盘的网格中。再将代表棋子的寡核苷酸分别放入，然后视察荧光输出情况进行判断。2.3 与DNA链置换相结合的荧光技能该技能多用来构建DNA逻辑门。其巧妙利用DNA分子的粘贴，通过参加引发链，来释放另一DNA链。在逻辑盘

13、算中，这种技能具有循环性、自引发性、反馈性、灵敏性和准确性等特点。近年来在science等高水平科研杂志上都颁发了大量系列事情，并且在生物检测领域具有遍及的实际应用前景。2000年，Bernard Yurke构建了一种DNA链置换呆板，在置换历程中可以实现闭合式运动12。2003年，B. Yurke等构建了一种基于DNA链置换的纳米呆板13。Jong-Shik Shin等利用可重复的DNA链置换，构建了可以重复读取和输入的三状态存储器14。2006年，Georg Seelig等对DNA链相互粘贴、置换的几种模式进行了实验15。2006年，Simon J. Green等用茎环结构实现了DNA链的

14、粘贴交换16。2007年，David Yu Zhang等实现了DNA链置换的循环进行17。2007年,suvir venkataraman等实现了通过DNA链自粘贴来完成多段DNA聚合延伸18。下面介绍两个具有代表性的事情。2006年，Georg seelig 等报道了一种没有酶到场的DNA逻辑门19。其根本原理如图4-1所示，即先构建好由寡核苷酸链G、Eout、F配合杂交组成的DNA互补结构，再参加Gin寡核苷酸链。此时，由于Gin一侧末端和G的一侧单链末端互补，从而使逻辑门中的G寡核苷酸链被释放，与Gin形成互补双链。此时的互补结构中，只剩下了寡核苷酸链Eout和F。然后再参加Fin寡核苷

15、酸链，Fin的一侧末端与F中间有互补序列，加之Eout自己形成的是单链环状的不稳定结构，于是，F和Fin结合成双链。Eout寡核苷酸链被释放。文中使用了荧光标志地对Eout的释放情况进行了检测（如图4-2所示）。Eq末端标志有荧光基，而Ff末端标志有荧光淬灭基。当其互补结构存在时，荧光恰被淬灭，从而无法检测。但是，当Eq和Ff分散时，荧光就被释放出来，从而表明DNA链的分散情况。上述由G、Eout、F的DNA互补结构就可以组成与门。也就是说，只有同时参加Gin和Fin，才气诱发释放出荧光。值得注意的是，文章并不但是提出这种DNA盘算逻辑门，而是将其应用到生物基因检测的中。在鼠脑总RNA中，乐成

16、的检测了数个基因的表达情况。图4-1链置换原理示意图 图4-2荧光标志原理示意图2008年，Peng Yin等对这种DNA自粘贴、链置换进行了更为精细的研究20。其主要原理是利用DNA茎环结构的链置换。如图5-1所示，茎环结构A是由at、a、b、bt、ct、c等DNA序列组成的，在茎环结构末端有未互补的单链DNA区域。如果参加与末端单链DNA互补的序列，整个茎环结构就会打开（图中的at与at*可以互补，其它同理）。因此，当体系中只参加A、B这两种茎环结构时，相互之间无任何影响。但是，当体系中参加了寡核苷酸链I后，就触发了整个循环。I先和A末端互补，使得A的茎环结构打开。此时，A的Bt区域与B的

17、Bt*相互作用，使得B的茎环打开。当B完全打开后，B的a*区域会与I竞争A的a区域形成互补结构。被置换掉的I就可以重新引发新的循环。 在上述底子之上，Peng Yin等设计了多种庞大结构的实验：直线型、回路型、支架型、自动位移型（见图5-2）。直线型指I与A、B、C组件是逐级触发，形成串联干系。回路型指到场的引发物在循环结束后又被释放，从而再次作用于系统。并且构建了多个循环相互镶嵌的庞大体系。支架型指在整个触发历程中，不但是线性的作用偏向，并且是向二维平面的扩展。自动位异型则是用链置换实现了特定DNA序列的位移。在这些实验中，荧光技能发挥了重要的作用。其中主要是将荧光基标志在茎环的一端，另一端

18、则标志有荧光淬灭基。只有茎环结构打开，才气够检测到相应的荧光。凭据标志差别的荧光，可以了解整个循环的反响速度，和反响水平。尤其是在自动位移型实验中，通过检测荧光，可以得知特定DNA序列在特定时间移动的位置。图5-1 茎环结构DNA置换原理 回路型直线型自动位移型 支架型图5-2 几种庞大类型：直线型、回路型、支架型、自动位移型2.4 与基因缄默沉静技能相结合的荧光DNA逻辑门2007年，keller等创造性地使用活体细胞，利用RNAi技能，通过控制特异基因的表达，构建多重逻辑门。这种技能将DNA盘算和基因表达、疾病诊疗有机的结合在一起，为DNA盘算的应用指出了另一偏向21。RNAi技能是近年来

19、生长起来的特异性缄默沉静基因技能，其根本原理就是将想敲除的基因序列大概部门序列构建到特定载体中，经过转录，形成部门序列的反义RNA（还可以通过直接参加特异的反义短寡核苷酸进行基因敲除）。这些RNA很快就可以被酶解为小片段，并与相关的卵白质形成复合体。于是，这种复合体就可以凭据RNA来识别特定的mRNA，从转录水平消除特定基因。keller等利用载体序列的线形串联排列以及基因表达的调控原理（非翻译区UTR对下游基因转录的影响），构建了多个逻辑门模型。（1）或门，如图6-1a所示，mRNA1和mRNA2分别与荧光卵白基因串联。这两个mRNA只要有一个正常转录表达，就会有荧光卵白输出。因此，形成了“

20、或”的干系。（2）与门，如图6-1b所示，Target A、Target B序列是串联漫衍。假设有A、B两种内源物分别抑制siRNA-A和siRNA-B对TargetA、B的影响。那末只有同时参加A、B时，才气完全抑制RNAi作用，也就是说，此时荧光卵白才气正常表达。因此A和B形成“与”的干系。（3）非门，如图6-1c所示，假设内源物A对siRNA-NOT（A）有激活作用。当参加A后，将会抑制Target-NOT（A）的表达，此时直接导致荧光卵白产物的淘汰。将这些简朴的逻辑门组合起来，就可以实现庞大的逻辑运算，如（A AND C AND E） OR（NOT（A） AND B），见图6-1d。首

21、先确定A、B、C、E与各个siRNA之间的干系，如：参加A抑制siRNA-A，促进siRNA-NOT（A）。当A、B、C、E配合作用时，就可以凭据基因排列的线性干系自动进行逻辑判断。图6-1 RNAi逻辑门示意图 在上述一步完成的RNAi逻辑门的底子上，还构建了二层逻辑门。所谓一步完成是指参加的siRNA直接产生作用，低落荧光基因的表达。而二层逻辑门是指首先调控一级卵白质产物，再由一级卵白质来调控二级荧光卵白基因的表达。如图a所示，构建了AND运算逻辑门。mRNA1和mRNA2的表达都下降才气最大限度地淘汰Lac抑制子的表达，从而减小Lac抑制子对荧光卵白的表达抑制。这种多层逻辑门与细胞内的卵

22、白、基因调控极为相似，因此在疾病诊疗方面有着辽阔的应用前景。图6-2 二层逻辑门示意图2.5 与DNA自组装立体结构相结合的荧光技能DNA自组装是近期生长迅速的领域，也是具有应用前景的领域。其涉及编码、杂交、空间结构设计等多个方面。从自组装结构上分，自组装可分为一维线段结构、二维平面结构和三维立体结构。在DNA自组装结构的底子上，结合荧光标志技能，生长了许多精巧的DNA三维结构，如2008年Russell P Goodman等构建的四面体，其边还可以产生荧光标志的可伸缩茎环22。这些三维结构不但仅包罗有图像、结构信息，并且还能随着结构的变革应用于纳米技能、药物载体、DNA盘算等方面。2008年

23、Yossi Weizmann等的事情是将DNA自组装和荧光技能紧密结合的一个例子23。首先，利用DNA分子互补，将两环相打仗部门的DNA序列设计为互补，杂交后再经连接酶连接，就形成了稳定的环链结构。通过AFM电镜检测，也能够看到环链结构的存在。另外，将一个环状寡核苷酸牢固在有金包被的AFM电镜感到头上，而与其有互补序列的寡核苷酸则被牢固在镀有金的玻璃板上。当杂交并且被连接后，其感到力较未被连接有了显著提高，侧面说明环套结构的存在。在此底子上，还设计了将DNA环分别牢固在两个金微粒（1.4nm）上，然后利用内切酶进行切割分散的实验。实验结果证明，这些操纵都可以在环套结构上乐成实现。除了上述电镜检

24、测外，Yossi Weizmann等还利用荧光技能进行了一系列实验。首先，如图A所示，将四甲基罗丹明标志在短寡核苷酸上，通过杂交，形成环套和多个短寡核苷酸复合物。在电镜下，可以视察到柱状荧光条带。然后，使用四甲基罗丹明标志的凝血酶，当凝血酶结合在环套的侧面时，利用AFM电镜就可以视察到荧光条状DNA，并伴有多节膨大结构。同时，还对环套结构进行了类似的双荧光探针杂交，结果发明产生了荧光共振能量转移。因为只有当两个荧光基和淬灭基的距离小于5nm时，才会出现能量转移，因此，也说明环套结构是有序排列存在的。图7-1 环链结构组成 图7-2荧光段寡核苷酸和凝血酶标志的环链 图7-3 DNA盒子盖开闭示意

25、图2009年Ebbe S. Andersen等巧妙地将DNA荧光技能应用在检测纳米装置开启和闭合24。为了检测DNA分子纳米盒子的盖子的开闭，分别在盖子和盒体上标志了Cy3和Cy5荧光染料（见图7-3）。当参加“钥匙”DNA链时，盒子盖打开，两个荧光分子离开。此时，Cy3的荧光信号增加，而Cy5荧光信号下降。在该实验中，利用荧光信号增减可以有效地检测DNA纳米装置的空间变革。2.6 与DNA变构相结合的荧光技能通过DNA分子的差别状态，构建可控的荧光纳米装置。随着DNA分子的变构，其荧光强度也随之变革。因此，通过检测荧光强度就可以知道DNA分子的构象变革。1999年，Mao等构建了一种基于DN

26、A分子变构的纳米装置25。其应用的原理就是B、Z型DNA的相互转换。B-DNA就是我们所熟悉的右手螺旋结构。但是，对付含有多个GC的重复序列，当离子浓度产生变革时，就会伸展为左旋结构。如图8-1所示的DNA复合结构是由三条链组成的。其中，蓝色的两条链相同。在每个连接的转折处都由4的相连的T组成。在这个复合结构的中部，也就是黄色标志的序列，其中含有多个GC的重复序列。当改变离子浓度时，该区域就会伸展成为左旋结构。将荧光发射基和吸收基牢固在如下所示位置（圆点）。那末只有当复合结构是B-DNA时，才气通过能量转移引发出荧光。当其为Z-DNA时，由于两个基团距离加大，从而无法实现能量转移。图8-2为B

27、、Z型DNA转换时其能量转移的变革。图8-1 DNA复合结构变构示意图 图8-2 DNA转换时其能量转移3 近期荧光技能的新生长荧光技能生长速度很快，在DNA盘算、信息学、物理学等诸多领域具有很大的应用潜力。下面介绍几种近年来生长起来的新型荧光技能，希望能为DNA盘算提供新的思路。（1）荧光分子信标信号放大技能；（2）与磁珠技能相结合的荧光技能（3）与PH值变革相结合的DNA荧光技能；（4）与miRNAs检测相结合的荧光技能。3.1荧光分子信标信号放大技能分子信标技能是目前较为成熟的技能，尤其是在检测方面有着重要的应用。但是当检测物很少时，分子信标产生的荧光就不敷以被检测，甚至产生错误信号。2

28、008年，Gary K Geiss等报道了一种基因表达的多色荧光阐发系统26。其中使用了牢固化、探针捕获、多色荧光标志等多种技能。2005年，Ernest K. Lewis等设计了能同时引发多种荧光的要领，使得DNA检测速度以及准确度都大大提高27。2008，Jianwei Jeffery Li等提高了荧光分子信标的信号强度28。其原理（如图9-1所示）就是先通过普通的分子信标杂交历程，待分子杂交产生荧光信号后，此时，参加特异的缺刻DNA酶，即将因杂交而展开的分子信标切断，并释放。从而，再进行新的一轮分子信标杂交释放。那末荧光信号就会积聚增多。在此底子上，还创建了一种增强型荧光分子信标信号放大

29、技能（如图9-2所示）。首先，与目标片断互补的单链DNA杂交，再使用连接酶进行连接成环。随后，利用DNA聚合酶29以环状DNA为模板，参加单引物进行PCR。在随后扩增的线性模板上，就含有多处目标片断。此时，再进行上述的荧光分子信标信号放大。就可以大大提高信号强度。图9-1 荧光信号积聚原理 图9-2 增强型荧光分子信标信号放大原理3.2与磁珠技能相结合的DNA检测荧光技能磁珠技能，使得DNA分子的捕获和释放变为可能。通过DNA特异性杂交，可以特异性的获取DNA分子。2005年，Hui Xu等就将磁珠技能与荧光技能相结合，创建新型的DNA检测系统29。首先，将标志生物素的DNA1与磁珠相结合。通

30、过目标DNA3，可以使DNA1、2、3相互杂交，形成复合体。在DNA3上标志有荧光团体。通过磁珠分散，将捕获的DNA2和目标DNA3洗脱。由于DNA分子本省带有负电荷，于是可以与带有正电荷的水溶性聚乙烯（被标志有特殊基团）吸附。此时就会产生能量转移，从而产生荧光，并被检测（如图10所示）。图10与磁珠技能相结合的DNA检测荧光技能原理3.3与PH值变革相结合的DNA荧光技能DNA的构象会随着PH值的变革而改变。利用这一特性，2005年，DongSheng Liu等构建了一种随PH值变革的DNA荧光装置30。整个装置是由DNA寡核苷酸阵列组成的。在每个寡核苷酸的5端标志有-SH，随后是由-CCC

31、C-4个胞嘧啶组成的DNA序列，在3端标志有若丹明绿色荧光基团。每个DNA寡核苷酸被牢固在金外貌。当PH值较低时（4-9之间），有些胞嘧啶会产生质子化，从而与其他胞嘧啶产生分子间非经典配对。此时，寡核苷酸链就会形成蜷缩状结构，而不会与互补链杂交（如图11-1所示）。在这种状态下，荧光团体非常靠近金外貌（约1nm），此时就不能被引发光引发。随着PH值的增大，胞嘧啶质子化水平低落，其分子间非经典配对也随之低落。若参加互补链，在金外貌，展开的寡核苷酸会与互补链杂交，使得寡核苷酸3端的荧光团体远离金外貌（约8nm）。当有引发光引发时，就会产生绿色荧光，实验还证实这种荧光的变革是可逆的。通过控制PH值，可以有效地进行荧光变革。图11-1 原理图图11-2 随着PH值荧光可逆地进行变革。a：PH值4.5；b：PH值9.0；：PH值4.5；：PH值4.5；3.4