体外诊断试剂干扰实验评估指南.docx

1、体外诊断试剂干扰实验评估指南体外诊断试剂干扰评估指南-EP7A 郑金来 20110105 目录 前言 干扰物及其机理干扰的标准干扰评估 干扰筛选及其效果评价 用病人标本评价干扰效果 临床实验室验证 总结前言NCCLS:国家临床化学实验室标准化委员会。 NCCLS是一家国际性的、各学科间的、非盈利性的标准制定和教育组织,推动在医疗团体间发展和使用自愿性一致的标准和指南。NCCLS已经得到了全球广泛的认可NCCLS基于的原理为一致性是一个有效并经济的手段来提高患者测定和医疗服务。WWW.NCCLS.org,EMAIL:*08年11月NCCLS已经更名为CLSI前言NCCLS文件以标准、指南或委员会

2、报告的形式发表 标准:通过一致性程序发展出来的一项文件,以一种未经修饰的形式、清楚地确定材料、方法学或使用惯例的特定以及必须的要求指南:根据一致性程序发展出来的一项文件,描述某个一般性操作惯例、程序或材料的标准,供用户自愿使用。使用指南时,可由用户根据其特定需要草拟或进行修改报告:还没有提交进行一致性回顾的一种文件,由董事会发布。前言NCCLS的标准和指南代表了有关良好医疗实践的一致性意见。反映了实质上受到影响的有资质的以及有兴趣的各方根据NCCLS建立的一致性程序得到的实质协定。即使符合自愿性一致文件,但用户仍有自认适合法规的要求。用户的意见对于一致性程序时必要的,任何人都可以向委员会提出自

3、己的意见。前言干扰物质是体外诊断试剂使用过程中造成测量误差的一个主要原因,针对体外诊断试剂进行的干扰实验是指通过实验查找出对体外诊断试剂测量结果产生影响的物质的过程。干扰实验评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据,也是产品注册所需的重要申报资料之一 CLSI EP-7A的范围生产商:通过科学的实验设计、指定干扰物浓度和类型以及合适的结果分析,帮助生产商或实验程序的开发者明确程序对干扰物的易感性。用户:通过系统的调查策略、指定数据收集和分析要求以及促进生产商和用户更好的合作,帮助临床实验室调查因干扰引起的有差异的结果,以便最终能够坚定、发现并评估新的干扰物。目录 前言 干扰物及其机理干扰的标准

4、干扰评估 干扰筛选及其效果评价 用病人标本评价干扰效果 临床实验室验证 总结干扰物的来源干扰物质来源:干扰物质可能来自内源或外源物质。可疑干扰物质的来源通常有:病理状态下的代谢物:糖尿病、骨髓瘤、胆汁郁积性肝炎病人治疗过程中引入的组分:药品、非肠道营养品、血浆膨胀剂、抗凝剂等。病人消化物:如酒精、滥用的药品(毒品、营养补充物、各种食物和饮料样品准备过程中的添加物:抗凝剂、防腐剂和稳定剂等标本处理过程中引入的污染物:手上的乳霜、手套的粉末、血清分离物、样品收集管的盖子等。样品基质本身的物理化学性质使其区别于理想的新鲜血。 干扰对准确度的影响总误差:由三部分组成不精密度方法特异性偏差:前两项常被关

5、注样品特异性偏差(即干扰影响分两类病人群体:平均的干扰物水平导致系统的偏差。相对于更特异的方法,单个病人的偏差被视为总体偏差的随机变异。单个病人:干扰物质引起的偏差与其浓度有关,随干扰浓度的改变而变。相对干扰干扰的分析总是相对于对照或者基础池。在一些情况下,对照池含有内源性的干扰物。例如:病人群体平均浓度水平的物质,胆红素、血红蛋白、蛋白、脂质。一些测量方法常对这些干扰物的平均浓度进行校正:标本前处理、空白、血清基础校正、数学校正。 干扰的机理化学效应:通过与试剂竞争抑制反应或者抑制指示物反应。也可能通过络合、沉淀改变分析物的形式检测效应:干扰物与分析物有类似的性质,如荧光、颜色、光散射、洗脱

6、位、电极反应,因而被检测物理效应:干扰物改变样本基质的物理性质,如粘度、表面张力、浊度、离子强度,进而导致分析物浓度的明显变化干扰机理酶的抑制:干扰物通过隔离金属离子激活剂、结合至催化位点、氧化必要的巯基等改变酶(分析物或试剂的活性。有时干扰物也会在酶基础上的测量程序中竞争关键的组分,如:腺苷酸激酶竞争肌酸激酶的ADP,导致检测错误。非特异性效应:干扰物以某些方式与分析物反应。如酮酸与苦味酸法检测肌酸时。干扰机理交叉反应:与分析物结构上类似,也是非特异的一种。如咖啡因干扰茶碱的检测。 水置换:非水的物质影响活性基础的检测通过置换水。 目录 前言 干扰物及其机理干扰的标准干扰评估 干扰筛选及其效

7、果评价 用病人标本评价干扰效果 临床实验室验证 总结如何设立干扰可接受标准在实施干扰评价前应先确定接收准则:应该考虑如下方面临床可接受准则统计显著性差异 临床可接受准则干扰引起的允许误差的程度明显依赖于测试的医疗用途。某些分析物已经建立了总允许误差,尚有部分未建立允许的干扰限通过对准确度标准分组:偏差、不精密度和干扰来确定。可见总的允许干扰误差是在扣除偏差、不精密度后的总准确度参与部分。 建立临床接受标准的方法基于生理学变异设定误差限以使分析变异相对于病人或病人群体内在变异最小该方法适用于受生理控制的分析物基于临床经验临床专家的一致意见可用于确定准确度要求。即:影响诊断或治疗决定的限度基于分析

8、学变异:通过长期不精密度来确定若高浓度干扰物的影响小于分析学变异,总误差的升高不可能显著影响临床决定,该物质不被视为干扰物。建立统计显著性差异在得出某物质是否有干扰作用时,评价者应该保证结果有显著性差异。应有足够数量的重复以确保有足够的把握度来检测临床显著性干扰、及合适的置信区间水平来认识无临床重大偏差存在。评价者事先确定多大的干扰偏差有临床显著性差异。该偏差即为干扰限或干扰标准。 通过假设检验来评价统计学差异无效假设:不存在干扰或未超过干扰限备则假设:干扰存在或者超过干扰限事先确定置信区间1-及把握度1-如何选择分析物浓度?建议用两个分析物医疗决定水平来评价干扰物的影响,有时,处于成本的考虑

9、,可以只做一个浓度。但是应该意识到在分析物其他浓度可能丢失临床显著性干扰的信息通常选择参考范围的上限或下限、以及病理学浓度水平 常见分析物浓度700pg/dL 250pg/dL 150ng/ml 30ng/L AFP高值低值名称40mIU/ml 200ng/ml 20ng/ml Ferr110mIU/ml 5mIU/ml 50mIU/ml 2.5ng/dL1ng/dL 8IU/ml 0.3IU/ml 300ng/dL 50ng/dL分析物浓度选择方法? 浓度选择依据:酶:2*或者10*人群参考区间的上限治疗性药物:零和治疗区间的上限其他:低和高、或者“正常”与“异常”值 干扰物列表在评价干扰前

10、应该编制潜在的干扰物列表,可从:出现在病人标本中、检测程序的化学知识以及预期用途等角度考虑。常见的异常标本,例如溶血、黄疸及脂血;药物:普通的处方药及非处方药;患者群体中常见的治疗药物;干扰测量程序的药物(包括代谢物患者群体中异常的生化代谢物;已报道干扰相似测量程序的物质;标本处理过程中的添加物,例如抗凝剂(肝素、EDTA、柠檬酸、草酸盐、防腐剂(NaF、碘乙酸酯、HCl等;采集及处理过程中接触标本的物质,例如血清分离设备、导管、标本收集容器及塞子;影响某些实验的膳食物质,例如咖啡因,-胡萝卜素,罂粟籽干扰物列表有些干扰物可根据报道、知识等从列表中去除,但是需要记录排除的原因与列表中已有的结构

11、和组成相同的物质。已有文献报道,采纳同样原理的测试程序中没有出现干扰的物质。基于测试程序的化学性质和化学知识,专家们认为不可能干扰的物质。基于对测试程序的了解,因剂量过低不可能引起干扰的处方药药物因代谢或清除过快,不可能以干扰浓度出现在分析时的物质干扰物浓度确定某物质是否会在极端恶劣的情况下引起干扰,用最高浓度进行广泛的干扰筛查是必要的。原则上:由于阴性和阳性干扰效应可能是由于不同的机理引起的,应该测试两种不同的浓度以避免因竞争效应导致的信息丢失。 药品和代谢物的浓度血清、血浆和全血:至少3倍峰值或预期最高值(如已知;如血中浓度未知,治疗剂量溶于5升血中的浓度,测试3倍的这个浓度尿:确定24小

12、时内清除的最大量,测试每升尿中至少3倍这个量;如果不了解尿清除,测试每升尿中至少3倍的治疗剂量。 内源性物质干扰物浓度确定目标病人群体中的最高值并测试这个浓度。342mol/L 推荐测试浓度病理浓度名称2.76mmol/L 342mol/L 11.1mmol/L2g/L 2g/L0.696mmol/L甘油,游离型内源性物质干扰物浓度续120g/L 推荐测试浓度病理浓度名称60g/L 60g/L 37mmol/L抗凝剂和防腐剂浓度血清、血浆和全血:5*推荐的添加物浓度以模拟部分混血管尿:测试每升24小时收集的尿的防腐剂浓度的5倍mol/L 155单位推荐测试浓度U/L3000mol/L 21硫酸

13、庆大霉素mol/L 3.4食品物质的浓度血清、血浆和全血:至少3倍最大预期浓度 尿:每升24小时尿的清除量的5倍 样本收集和处理过程中干扰物浓度将收集装置与样本池接触24小时。样本体积应基于实际使用的最坏状态避免样本挥发和不稳定分析物的损失对照:除不接触测试装置外,其余相同 质量保证与控制在实施评价实验前:操作者必须熟悉仪器设备及测量程序对精密度及准确度进行评价在进行实验设计时要避免携带污染效应影响分析结果,确保分析系统保持稳定 目录 前言 干扰物及其机理干扰的标准干扰评估 干扰筛选及其效果评价 用病人标本评价干扰效果 临床实验室验证 总结干扰的评估两种评估干扰物质的基本方法加样回收法:将可疑

14、干扰物质加入样本以评价干扰效果真实标本法:测量个别有代表性病人标本,相对于高特异性可比较的测量程序评价被分析测量程序产生的偏倚每一种方法都有它的优点及内在局限性,当两种方法同时使用时,可提供相互补充的信息。干扰筛查评价很多可疑干扰物质在相对较高浓度下所产生的干扰,称此为“干扰筛查”。将可疑干扰物质加入基础样本池,计算实验样本相对于对照样本测量结果所产生偏倚,称此为“配对差检验”。如果可以观察到临床显著性影响,可以认为此种物质为干扰物质,需要进一步评估干扰物质浓度与干扰程度的关系。注:没有一种干扰评价策略可以评价出所有的干扰物干扰筛查的局限性加入血清池的组分性质可能与真实的血液循环中的有区别有区

15、别的干扰效应可能出现在干扰物和分析物某个浓度。基于这个原因,在评价血红蛋白对胆红素检测的影响时,总会用多个胆红素的浓度。 每个干扰物至少在两个分析物浓度下测试。加样回收法与真实标本法联合应用才可以给出关于干扰的真实结果。 筛查试验设计对照样本和测试样本需在一个分析内以同样的方式、足够的重复当做病人标本检测。足够的重复是用以减少错误的拒绝无效假设(1类错误和拒绝备则假设(2类错误的可能性。样本的测试倍数与:置信区间、把握度、重复性和临床意义的最小区别的程度。干扰筛查实验材料的基本要求 干扰物实验浓度:干扰物质浓度应达到病理标本的最高浓度值。分析物实验浓度:分析物实验浓度应选择两个浓度水平。在大多

16、数情况下,可选择医学决定水平、参考范围的上、下限或病 理浓度 测试材料基础样本池:从一些未服用药物的健康个体获得新鲜标本。其基质应反映目标标本的基质。若不能获得新鲜标本,可使用冷冻或冻干的标本代替,但应保证实验材料充分接近新鲜临床标本。使用适当纯度的分析物将样本池中分析物的浓度调整到医学决定水平,但要避免引入其它的干扰物质测试材料储存溶液:每种潜在的干扰物准备一种适当纯度或者最接近循环形式的可疑干扰物质。如是药品级别的干扰物,在制备时应考虑其中所含的赋形剂、防腐剂、杀菌剂、杀真菌剂、抗氧化剂、色素、甜味剂、金属氧化物等是否会导致干扰选择一种实验物质能充分被溶解的溶剂,例如试剂纯水、稀释的HCl

17、或NaOH、甲醇或乙醇、丙酮、二甲亚砜(DMSO及其他有机溶剂。溶剂溶剂不能有干扰的影响。制备至少20倍干扰物实验浓度的储存溶液材用有机溶剂配制溶液,需要关注溶剂的挥发性。储存液应配制最高的浓度点。一些有机溶剂在血清中溶解度很低,氯仿需要1:100倍以上稀释。乙醇的浓度超过1-2%,可能使抗体变性。对照样本池除干扰物外,其他性质与测试样本池一致 用干扰物的溶剂代替干扰物溶液加入对照中。如果干扰物出现在了对照池中,应确定其浓度。如果对照池中分析物的表观浓度与基础池相比不同,应将溶剂作为一种干扰物评价重复数要求为获得一定置信区间和把握度的结果,应有一定重复数的要求双尾检查:当备则假设未给出干扰的方

18、向时使用;单尾检查:当备则假设给出了干扰的方向时使用。 重复数计算每个标本所需要的重复测量次数:双侧检验的实验重复次数见公式,单侧检验用Z 1-代替Z 1-/2Z 1-/2是双侧检验的可信度为100(1-% 时标准正态分布相对应的百分位数;Z 1-是单侧检验的可信度为100(1-% 时标准正态分布相对应的百分位数; Z 1-是把握度为100(1-%时标准正态分布相对应的的百分位数;d max 是检测分析物浓度时最大允许的干扰; s 是测量程序的重复性标准差 Z-值 常用Z值见下表 简化重复数 按照95%置信区间和95%把握度 实验过程选择适当的分析物浓度;建立一个临床上显著性差别(dmax的标

19、准;决定每个样本的重复次数;制备一个基础样本池;制备一个储存溶液制备实验样本,将储存溶液加至容量瓶体积的1/20,再用基础样本加至刻度,混匀;制备对照样本,将溶剂加至另一容量瓶体积的1/20,再用基础样本加至刻度,混匀;在同一批测定中,交替分析实验(T及对照样品(C,例如C1T1C2T2C3T3.CnTn;记录分析结果数据处理计算d obs 、d c 及95%可信区间。d obs 是实验、对照样本分析物平均值的差值公式为: 在双侧检验中: 在单侧检验用Z1-代替Z 1-/2 95%可信区间的计算公式为: n 为每份标本重复测量数,dnull 经常取值为0 当n 30时,t=2.0 结果判断准则

20、当dobs 小于或等于dc时,不拒绝无效假设,认为检测物质不是干扰物质;当dobs 大于dc时,拒绝无效假设,接受备择假设,认为检测物质是干扰物质。当95%可信区间的下限小于或等于dmax ,认为检测物质不是干扰物质;当95%可信区间的下限大于dmax,可认为检测物质是干扰物质 数据分析干扰物质对实验结果的影响,一般是通过测定对照或基础样本池中待测物的浓度计算得出的。 在某些情况下,对照样本池中可能含有一定量的内源性干扰物质,如胆红素、血红蛋白、蛋白质和脂类。在一些测量程序中,采用标本前处理、样本空白、血清基质校正物和因子校正等手段以减少这些干扰物质在平均浓度下的影响,只有当患者样本中干扰物质浓度高于或低于平均水平时,由于干扰物质引起的误差才会显现出来。干扰效果评价如果在一个或多个分析物质浓度发现干扰,进行剂量反应实验以确定干扰物质浓度与干扰程度的关系建议每个测试浓度3复孔。实验材料和基本要求 基础样本池;储存溶液;高值样本池:基础样本池稀释储存溶液以达到所需浓度;低值样本池:准备一个干扰物质浓度接近临床标本平均浓度的样本池