细胞转染技术.ppt

1、细胞转染技术一一：转染的简介：转染的简介二二：转染的分类：转染的分类三：三：转染的方法转染的方法一一、转染的简介转染的简介1.1.基因转染基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。使核酸在细胞内维持其生物功能。2.2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。疗研究。二二 、转染的分类、转染的分类瞬时转染瞬时转染稳定转染稳定转染目的目的快速分析快速分析为获得稳定表达为获得稳定表达外源基因的单细外源基因的单细胞克隆胞克隆 目的目的DNADNA与宿主染与宿主染色体色体

2、未整合未整合整合整合表达持续时间表达持续时间随细胞分裂而稀随细胞分裂而稀释至丢失释至丢失48487272小时小时 随宿主随宿主细胞本身胞本身基因基因组一一样复制，复制，转录，翻，翻译，并，并被被稳定定遗传 筛选办法筛选办法抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性抗生素抗性基因转染真核细胞的方法基因转染真核细胞的方法转染方转染方 法法化学化学 转染法转染法物理物理 转染法转染法病毒病毒 感染法感染法DEAE一一葡聚糖法葡聚糖法显微显微注射法注射法逆转录病毒逆转录病毒磷酸钙法磷酸钙法电穿孔法电穿孔法腺病毒腺病毒人工人工脂质体法脂质体法基因枪法基因枪法 是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE-葡聚糖是

3、阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。DEAE-DEAE-葡聚糖法葡聚糖法磷酸钙共沉淀转染法磷酸钙共沉淀转染法 由由于于试试剂剂易易得得、价价格格便便宜宜而而被被广广泛泛用用于于瞬瞬时时转转染染和和稳稳定定染染的的研研究究。方方法法是是，先先将将DNADNA和和氯氯化化钙钙混混合合，然然后后加加人人到到PBSPBS中中慢慢慢慢形形成成DNADNA磷磷酸酸钙钙沉沉淀淀，后后把把含含有有沉沉淀淀的的混混悬悬液液加加到到培培养养的的细细胞胞上上，通通过过胞胞膜膜的的内内吞吞作作用用摄人摄人DNADNA。脂质体介导法

4、（目前应用最广泛）脂质体介导法（目前应用最广泛）原理：阳离子脂质体试剂与原理：阳离子脂质体试剂与DNADNA混合后，形成一种稳定的混合后，形成一种稳定的脂质双层复合物，脂质双层复合物，DNADNA被包在脂质体中间，这种脂质双被包在脂质体中间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细层复合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合，胞表面并与细胞膜融合，DNADNA被释放到胞浆中。被释放到胞浆中。n此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒此图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。进入细胞的一般过程。【主要应用主要应用】:瞬时

5、转染瞬时转染 稳定转染稳定转染.【特点特点】：使用方法简单，可携带大片段：使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于，通用于各种类型的裸露各种类型的裸露DNA或或RNA，能转染各种类型的细胞，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限制。用受限制。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体

6、与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。巨大的作用。物理方法物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪电穿孔、显微注射及基因枪)（1 1）电穿孔法）电穿孔法 利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮

7、细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。(2(2）显微注射法）显微注射法 该该法法虽虽然然费费力力，但但却却是是非非常常有有效效的的将将核核酸酸导导人人细细胞胞或或细细胞胞核核的的方方法法。这这种种方方法法常常用用来来制制备备转转基基因因动动物物，但不适用于需要大量转染细胞的研究。但不适用于需要大量转染细胞的研究。（3 3）基因枪法）基因枪法 该该法法依依靠靠携携

8、带带了了核核酸酸的的高高速速粒粒子子而而将将核核酸酸导导人人细细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。实验室用到的转染方法脂质体介导法脂质体介导法细胞转染Lipofectamine 2000转染试剂：以HEK193细胞为例：n转染前一天，将细胞铺到培养皿中，n加入有血清无双抗的培养基（15ml）；n24小时候换上无血清无双抗的培养基12ml；n将所需的质粒用1.5ml无血清无双抗的培养基稀释；取40ul的Lipofectamine 2000加入无血清无双抗的培养基稀释，室温放置5min；n5min后将质粒和Lipofectamine 2000混

9、合在一起，室温放置20min后加入培养皿中，4h后换上完全培养基48h培养；注：注：24h看一次，如果培养基变颜色换培养基；转染的影响因素转染的影响因素 细胞细胞（1 1）分裂细胞相比较非分裂细胞）分裂细胞相比较非分裂细胞 （2 2）贴壁细胞相比较悬浮细胞）贴壁细胞相比较悬浮细胞 （3 3）传代次数）传代次数 （4 4）细胞数量（融合率）细胞数量（融合率）2 2 交叉污染交叉污染n如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。如有许多细

10、胞系被这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLaHeLa细胞细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。3 3 载体载体DNADNA 对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。载体做对照。（1）载体完整性）载体完整性（2）载体制备物）载体制备物4 4 组织培养试剂组织培养试剂一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。(1)(1)基础培养基基础培养基 (2)(2)胎牛血清胎牛血清 (3)(3)添加剂添加剂