纳米羟基磷灰石复合物修复骨缺损试验研究的影像第三军医大学学报.docx

1、纳米羟基磷灰石复合物修复骨缺损试验研究的影像第三军医大学学报纳米羟基磷灰石复合物修复骨缺损实验研究的影像学评价肖智博 吕富荣* 蒋电明 吕发金 李杰摘要 目的 通过MRI与X线方法检测纳米羟基磷灰石/聚酰胺（n-HA/PA66）复合材料应用于修复骨缺损实验研究，综合评价其成骨能力，为骨缺损修复后全面、准确的影像学评价提供理论依据。方法 48只新西兰大白兔行双侧胫骨髁钻孔，每16只为一组。每只兔子A组双侧分别植入n-HA/PA66复合材料和PMMA, B组双侧分别植入n-HA/PA66复合材料和CPC, C组双侧分别植入CPC和PMMA。术后2、4、6、8、12周各时相点摄DR片、MRI及增强M

2、RI检查，并取材进行组织学观察。 结果 (1) 增强MRI显示：n-HA/PA66复合材料内部从第4周开始有强化，并逐步扩大，周围软组织水肿的吸收也明显好于对侧；PMMA侧材料内部始终无强化；CPC侧6周以后开始由边缘强化到内部强化。三者内部强化率在各时间点均有显著差异（p0.01）。（2）X线显示：缺损填充区内的骨质增生修复变白的出现时间n-HA/PA66复合材料侧早于其他两侧。（3）组织学显示：n-HA/PA66复合材料组在412周时，逐步有骨小梁形成长入，材料被界膜分隔成小岛，界膜内可见大量间充质细胞、成纤维细胞及小血管，后形成破骨及成骨细胞，参与修复。PMMA植入侧材料始终未被包绕，界

3、膜内细胞形成纤维膜，但仍未见成骨细胞。CPC植入组612周界膜包绕材料，界膜内细胞及血管数量较少。结论n-HA/PA66复合材料具有良好的生物相容性和骨传导性，具有临床实用性；MRI联合X线能够清楚显示 n-HA/PA66复合材料，对早期骨移植的成功有很好预测作用，并兼顾术区周围关节及软组织的恢复显示，具有临床可操作性。 【关键词】骨移植；纳米羟基磷灰石；聚酰胺66； 复合材料 MRIThe Study of Radiology in the Experiment of Repairing Bone Defects with Nano-hydroxyapatite and Polyamide-

4、66 CompositeXIAO Zhibo*, LV Furong, LV Fajin. JIANG Dianming LI Jie *Department of Radiology，The First Affiliated Hospital ,Chongqing Medical University, Chongqing 400016,China吕富荣，通讯作者，重庆医科大学附属第一医院放射科，邮编400016 该课题为国家863计划子课题(2002AA326020）【Abstract】OBJECTIVE To study the MRI with X-ray in the ability

5、 of bony generation by the way of the experiment of repairing bone defects with n-HA/PA66 (nano-hydroxyapatite and polyamide-66 composite). This research can theoretically guide us in applying the radiology to evaluate the bone defects repaired with n-HA/PA66 composite in the clinic. METHODS 48 New

6、Zealand rabbits were classified randomly into three groups: A 、B and C，every group had 16 rabbits. The condyle of tibia was performed boring which was 3mm diameter and 5mm depth. In group A、B and C, n-HA/PA66 composite, PMMA (polymethylmethacrylate) and CPC (calcium phosphate cement) were implanted

7、dividedly by means of every two materials in every rabbit of one group. The specimens were taken respectively in different times:2nd 4th 6th 8th 12th week after surgery, and were examined by the methods of plain roentgenography、histology and magnetic resonance imaging. Finally the collected data was

8、 analyzed using SAS 8.0 software. RESULTS (1) MRI and X-ray: From the 4th week, n-HA/PA66 composite had the poor defined border and the signal inter-material had become more variform, more obvious enhancement. On the side of PMMA, the inner material was always low signal intensity. As to the side of

9、 CPC, till the 6th week, it showed high signal among the material. The rate of enhancement inner material of 3 groups was significant difference.（p0.01）.While in the X-ray, there were more bony generation on the side of n-HA/PA66 then the other two, happening earlier too.(2) The histology showed tha

10、t every group was forming a layer of interface membrane. From the 4th week, The interface membrane on the hand of n-HA/PA66 composite had been widest and revolved the n-HA/PA66 composite partly where the number of cells was increasing. Till the 12th week, there were some bone trabecula formed and th

11、e HA were separated into small islands, more osteoclasts appeared. The material of PMMA was never involved, at the 12th week, the interface membrane transformed into fibrous membrane. On the side of CPC, it was from 6th week that the number of osteoblast、osteoclast and the primitive bone trabecula w

12、ere increasing gradually and quickly, while the number of inflammatory cells decreased. CONCLUSION The experimental results show that the perfect radiology technique is useful to predict the bone transplantation. Furthermore it is easy to operate in clinical setting, and the n-HA/PA66 Composite has

13、the attribute of good biocompatility and osteoconductibity, which can be manifested by plain roentgenography and magnetic resonance imaging. 【Key words】 bone transplant, MRI, bone defect, nano-hydroxyapatite and polyamide-66 composite因创伤、肿瘤造成骨缺损的修复问题一直是困扰国内外骨科界的难题，到目前为止还没有系统综合的相应影像学检测评价，本实验着眼于临床骨缺损修

14、复后的常用的X线及MRI监测方法，进行探讨。骨移植后的三个基本过程是移植物血管化、骨再生及骨端融合，而移植物血管化是首要的关键环节。监测血管化对骨移植的预后尤其重要。磁共振成像（MRI）是继普通X线、CT之后的无创检查技术1。它具有独特的捕捉组织及其新陈代谢信号的能力2，动态增强磁共振已广泛应用于临床血管化骨移植的研究3。但对于实验动物骨移植后应用MRI成像技术的研究国内外尚未见到报到，作者采用此法与病理对照研究，从实验研究入手，探讨骨组织修复材料应用临床病人术后的无创全面检查方法，对该复合材料更广泛的应用提供科学依据。1 材 料 与 方 法1.1 实验材料实验材料为20%纳米羟基磷灰石/聚酰

15、胺复合材料（由四川大学国家纳米生物医用材料产业孵化中心提供）, 瑞邦骨泰（CPC）（由上海瑞邦生物材料有限公司提供）医用骨水泥（PMMA）（由天津市合成材料工业研究所提供）1.2 动物分组实验动物为48只同种系健康成年新西兰大白兔，体重2.50.5（由重庆医科大学动物实验中心提供）。适应性饲养一周后，随机分成A、B、C三组，行双侧胫骨内上侧骨皮质钻孔，造成柱状骨缺损，A组双侧分别植入n-HA/PA66复合材料和PMMA,B组双侧分别植入n-HA/PA66复合材料和CPC, C组双侧分别植入CPC和PMMA。1.3 实验方法 速眠新0.1ml/kg局部肌肉推注麻醉，取俯卧位，在无菌条件下，自髌内

16、侧纵切口，打开关节囊，暴露胫骨内上侧骨皮质，每侧钻1个直径3mm，深5mm的圆柱状骨缺损，保留缺损处骨皮质。明胶海绵充分止血后，将调制好的填充材料用注射器注入到骨缺损处，使其完全充满骨缺损，并用原位骨皮质覆盖。术后立即肌注青霉素40万U/只，连续3天，预防感染，不作外固定，分笼饲养。手术均由同一组人员完成。1.4 检查项目和方法 1.4.1 光镜组织学观察：术后第2、4、6、8、12周用空气栓塞法处死各组2只，用做组织学观察。1.4.2 DR检查：不同时相点行X线摄片，观察填充材料的分布、与周围骨连接、新骨形成情况以及填充材料降解吸收情况，周围骨质疏松情况及邻近关节的改变情况。 143 MRI

17、检查：肌注速眠新0.1ml/kg，麻醉后固定，采用GE signa 1.5T MR/i Hispeed plus核磁共振成像系统，常规行SE T1WI、GRE、FSPGR 、3D FSPGR及增强对比剂钆喷替酸葡甲胺（Gd-DTPA）1.5ml/只，用腕部线圈，观察周围软组织水肿、植骨区内部和周边的改变以及骨髓腔信号的改变情况，增强扫描了解植入区有无强化及强化程度。在MRI工作站利用其统计学功能，感兴趣区选定在病变显示最佳与最大层面，分别测量植骨区中心和边缘区域的信号强度。根据相对信号强度增加公式计算SI，即式中Sl为增强前病灶信号强度，SIC 为增强后病灶信号强度。1.5 统计学分析各组实验

18、指标的参数值用均数标准差(Xs)表示。结果经SAS 8.0统计软件处理，数据经方差分析后用配对t检验，P0.05为有显著性差异。结 果1 光镜组织学观察：术后24周，在各填充材料与宿主骨交界处形成界膜，n-HA/PA66侧材料内部呈均匀一片分布未见明显的细胞，周边部分材料被较厚的界膜包绕，其内可见大量间充质细胞、成纤维细胞及小血管（主要为新生毛细血管）；PMMA侧仅有少量界膜，仅少量成纤维细胞、间充质细胞及炎细胞；CPC侧术区的填充材料大部分被洗脱, 少量界膜内细胞也较少，较多是炎细胞，仅少量间充质细胞。（图）术后68周，n-HA/PA66侧界膜宿主面可见膜内成骨征象，内部血管增多，可见环状的

19、成骨细胞；PMMA侧材料未被界膜包绕，未见明确的纤维膜形成，炎细胞继续存在；CPC侧术区的填充材料被界膜分隔，细胞增多，炎细胞减少，原始骨小梁及成骨细胞层开始形成。术后12周，n-HA/PA66侧界膜内可见原始骨小梁形成，骨小梁表面为扁平状、排列整齐的成骨细胞，较多类骨质形成，纤维成分减少，材料被分隔成HA小岛；PMMA侧材料未被界膜包绕，界膜内可见大量成纤维细胞，未见成骨细胞；CPC侧术区的填充材料被分隔成CPC小岛，原始骨小梁增多。（图）术后24周，在各填充材料与宿主骨交界处形成界膜，n-HA/PA66侧材料内部呈均匀一片分布未见明显的细胞，周边部分材料被较厚的界膜包绕，其内可见大量间充质

20、细胞、成纤维细胞及小血管（主要为新生毛细血管）；PMMA侧仅有少量界膜，仅少量成纤维细胞、间充质细胞及炎细胞；CPC侧术区的填充材料大部分被洗脱, 少量界膜内细胞也较少，较多是炎细胞，仅少量间充质细胞。 （图1）术后68周，n-HA/PA66侧界膜宿主面可见膜内成骨征象，内部血管增多，可见环状的成骨细胞；PMMA侧材料未被界膜包绕，未见明确的纤维膜形成，炎细胞继续存在；CPC侧术区的填充材料被界膜分隔，细胞增多，炎细胞减少，原始骨小梁及成骨细胞层开始形成。术后12周，n-HA/PA66侧界膜内可见原始骨小梁形成，骨小梁表面为扁平状、排列整齐的成骨细胞，较多类骨质形成，纤维成分减少，材料被分隔成

21、HA小岛；PMMA侧材料未被界膜包绕，界膜内可见大量成纤维细胞，未见成骨细胞；CPC侧术区的填充材料被分隔成CPC小岛，原始骨小梁增多。（图2）2.2 X线摄片观察结果：术后26周，双侧骨缺损区的填充材料和周围骨之间可见透光带，n-HA/PA66复合材料侧呈略低密度影；PMMA侧呈明显高密度影；CPC侧呈较高密度影，邻近关节无明显改变，未见明显的骨膜反应。术后8周，n-HA/PA66复合材料填充区可见类圆形较高密度影，界线不清；PMMA填充区仍为高密度致密影，周围骨小梁与之分界清楚；CPC填充区密度逐步减低，小梁逐步伸入。术后12周，n-HA/PA66复合材料原来中等密度填充区内可见高密度影，

22、与周围界线不清，附近骨膜反应明显；PMMA填充区仍为中高密度致密影，周围骨小梁与之分界清楚，周围骨膜反应不明显；CPC填充区又呈高密度影但与周围分界不清，有小梁伸入，周围可见骨膜反应。2.3 MRI检查结果：术后24周， n-HA/PA66复合材料在T1WI上呈高信号影，在T2*WI上呈中等低信号影；PMMA和CPC平扫都是低信号影。术区周围均可见软组织水肿呈高信号改变，植骨区周围的髓腔内高信号改变，为髓内水肿。增强扫描：周围软组织水肿区强化明显，髓腔内也可见到片状不均匀强化区，n-HA/PA66复合材料侧填充区周边强化高于正常髓内强化，在骨与材料交界区亦有中度强化，填充区内强化不明显；PMM

23、A 侧和CPC侧填充区周边有部分强化、内部未见到强化。（图3）术后68周，平扫n-HA/PA66复合材料在T1WI上呈中高信号影，在T2*WI上呈中等略低信号影，余材料的填充区信号表现同前，n-HA/PA66复合材料侧内部信号不均匀，与骨髓分界不清。增强扫描：周围软组织水肿进一步减轻，髓腔内也可见到片状不均匀强化区也减少，n-HA/PA66复合材料填充区周边强化范围的大小和程度仍高于其他材料侧，填充区边缘交界处的强化程度增加；PMMA 侧填充区周边有部分强化，内部未见到强化；CPC侧填充区交界处及内部有轻微强化。术后12周，平扫n-HA/PA66复合材料植入区信号有所下降；PMMA 侧填充区远

24、端髓腔内不均匀信号范围增加；CPC植入区内信号下降，不均匀，边界不清。增强扫描：n-HA/PA66侧填充区内强化程度仍高于其他材料，较前亦有增高，髓内信号较均匀；PMMA 侧内部仍未见到强化，但植入区以远髓腔内较大范围不均匀强化；CPC侧植入区内部有轻微强化改变，近端髓腔内有强化。（图4）2.4 MRI信号强度增强率(SI)的测定(见表1) 各组材料在4W时的强化率最低，且低于2W时，以后呈逐步升高趋势；植骨中心区总体有显著差异p0.01,各组之间有显著差异p0.01；植骨周边总体无显著差异,但在6W8W12W时组间出现显著差异p0.05。3 讨论本实验中结合了普通X线以及MRI技术，利用X线

25、对于骨骼密度改变的反应来说明移植物和宿主的融合能力，又利用动态增强磁共振(DCEMRI) 进行检测，力图早期监测植骨区内血管生成情况，及周围软组织改变。DCEMRI是在注射磁共振对比剂前、中和后连续获得一系列磁共振图像，可以全面描述对比剂进入和排出血流的动力学过程，因而提供了观察局部组织内在血管的可能。目前该方法广泛用于监测多种肿瘤内部血管属性，区分其良恶性以及对其各种治疗效果(包括：化疗、激素调控、放疗以及新的治疗方法如抗血管生成药物)，描述治疗所引起的肿瘤微血管结构与功能的变化5。同时也逐步应用于肿瘤血管生成的监测，邹煜6等研究就表明动态增强MR方法能较好反应肺癌血管的生成。同时，MRI也

26、用于兔眼眶植入羟基磷灰石义眼台血管化范围和程度的评价7。本研究表明，2周时，MRI检测发现各组材料植入区周围有较髓内还明显的强化，且材料周围及中心的强化率高于4周时指标，这与各组材料周围的界膜内血供较多一致，属于炎性反应范畴。此时，光镜下各组材料在与宿主交界区都形成了界膜，但每组材料周围的界膜厚薄不一，最后的转归不同。柴本甫8等认为，结缔组织中最常见的成纤维细胞，能合成分泌I型胶原和蛋白多糖，构成基质，并通过线粒体提供钙颗粒，参与钙化过程，具有明显的成骨作用。n-HA/PA66复合材料的HA晶体的刺激使骨细胞活跃，提供晶体核成为新骨形成的支架，发挥的是骨引导作用9，从而加速血管化过程，促进骨的

27、生成；而对照组PMMA和CPC则缺乏相关生物特性，所以n-HA/PA66复合材料具有更好的生物相容性和骨传导性。组织学结果也表明第6周开始，n-HA/PA66复合材料侧界膜宿主面见膜内成骨征象，内部血管增多；CPC侧成骨细胞及血管逐渐增多，炎细胞逐渐减少；PMMA侧界膜向纤维膜过渡，成骨细胞没出现。此时，MRI表现出n-HA/PA66复合材料及CPC植入区与周围骨髓分界变模糊，植入区内部开始出现强化区，n-HA/PA66复合材料侧的强化程度明显高于CPC，两者强化有显著差异（p0.01），PMMA植入内部仍无强化；三者植入边缘仍都有强化且n-HA/PA66复合材料及CPC侧的强化与PMMA侧之

28、间强化程度有显著差异（p0.05）。至12周时MRI检测三组材料内部强化程度之间仍有显著差异（p0.01），PMMA植入区内部仍没有强化；而植入区周边强化程度n-HA/PA66复合材料及CPC侧之间没有差异，与PMMA植入侧则有显著差异（p0.05），此时显微镜下可见n-HA/PA66复合材料侧及CPC侧原始骨小梁形成增多，骨小梁表面为扁平状、排列整齐的成骨细胞，较多类骨质形成，纤维成分减少，材料被分隔成HA小岛及CPC小岛；同时PMMA侧材料未被界膜包绕，界膜内可见大量成纤维细胞，未见成骨细胞。动态增强早期明显强化区血管活性强，微血管密度（MVD）高；而强化较弱的区域血管活性较低，内部微血管

29、较少10、11。我们知道，MVD测定技术属创伤性检查，且MVD测定方法较繁琐，所得结果只能反映小区域血管生成情况，无法动态地对血管生成活性进行功能性评价12，本研究利用无创动态增强MR方法检测修复区强化情况，与组织学表现结果一致，表明动态增强MR可以无创性监测骨缺损修复新骨形成的骨基质中原始微血管的形成过程。同时利用MRI检测，各材料间的信号在平扫就有很大差别。n-HA/PA66组的短T1、长T2表现在材料的演变过程中就更易于观察，不同于PMMA及CPC的短T1、短T2表现。同时应用梯度回波扫描，动物的骨髓就呈中等信号，更易发现髓腔内信号改变，对于材料周围的组织水肿的观察更清楚，邻近关节腔的变

30、化更敏感。本实验发现，在术后第4周，材料内部强化值有所下降，结合组织学观察，可能是早期的炎症反应性强化过后，只有少量新生血管，材料内部血供下降造成的。4周前，由于有纤维阻挡作用，成骨细胞通过传导长入则较困难，这时的血管密度并不高。对于材料内部的成骨细胞可能来源于间充质细胞，同时在材料宿主界面有膜内成骨征象。6周开始，界膜内的间充质细胞向成骨细胞转化，以及膜内成骨增多，材料内部的血管生成随之增多，强化程度随之增加。同时本实验发现n-HA/PA66组最早出现成骨细胞在第2周开始材料就被包绕，第4周开始出现成骨细胞，第6周开始出现原始骨小梁。CPC组到第6周后才开始出现成骨细胞，第8周开始出现原始骨

31、小梁。但两者在12周时基本一致，对于长期效应，还需继续研究。总之，用磁共振成像与X线结合，对于骨缺损修复植入区的血管化监测及植入材料的分辨效果较好；增强MRI扫描能够定性检测材料内部血管化，并对移植骨预后的进行监测。同时证明了n-HA/PA66复合材料具有良好的生物相容性和骨传导性，具有临床实用性。参 考 文 献1. Hawighorst H, Libicher M, Knopp MV, Moehler T, Kauffmann GW, Kaick G. Evaluation of angiogenesis and perfusion of bone marrow lesion: role o

32、f semiquantitative and quantitive dynamic MRI. J Magn Reson Imaging, 1999，10：286-2942. Keen CL, Jue T, Tran CD, Vogel J, Downing RG, lyengar V, Rucker RB. Analytical methods: improvements, advanceme and new horizons. J Nutr， 2003，133：1574-15783. Tan CF, Ng KK, Yem PS, Ng SH, Cheung YC, Wan YL. Viability of vascularized bone grafts; perfusion studies by dyanmic enchanced MRI and bone scan. Transplant Proc， 2001，33：6236244. Lewandrowski KU, Tomford WW, Schomacker KT, Deutsch TF, MankinHJ. Improved osteoinduction of cortical bone