高级生化酶.docx

1、高级生化酶生物物理 陈洪阳 220100906081DegP分子伴侣蛋白酶通过形成笼状的寡聚物结合到底物蛋白上而激活细胞利用分子伴侣和蛋白酶执行主要的蛋白量控制机制。DegP蛋白，主要和Escherichia大肠杆菌细胞在升高的温度中存活有关，在所有组织中发现的同族体都具有这两种功能。这里，我们报道一种机制，DegP在于底物结合后通过形成大笼状激活这两种功能。Cryo电子显微镜和生物化学研究揭示两种寡聚体都是由DegP三聚体组装成的，这两种寡聚体通过相邻的三聚体通过成对的PDZ1PDZ2相互作用形成的。这中相互作用同时减弱PDZ2结构域的抑制作用。此外，这两种寡聚体都在大肠杆菌的细胞提取物种发

2、现，有力的说明它的生理重要性。cryo-electron microscopy _ protein quality control _ HtrA _ PDZ domain_oligomerization生命很大程度上依赖这些数量特别大的蛋白的功能，大多数这些蛋白没有稳定的结构，它们中有功能的蛋白量受到连续的调控，如果这种调控出现故障，将导致严重的疾病。分子伴侣和蛋白酶都结合与没有折叠的底物蛋白上，这两种蛋白家族都用于细胞的蛋白量控制过程中。DegP，在Escherichia大肠杆菌细胞周质中的蛋白，就是一种具有这样两种功能的蛋白，表现出双重的蛋白酶-分子伴侣活性在ATP-依赖的方式中，使它在蛋

3、白含量控制机制中成为一种独特的情况，DegP的一些同族物都已经在大多数组织中被鉴别，并且相信在逆境环境中保护细胞。DegP蛋白是有一个蛋白酶结构域和两个PDZ结构域组成。蛋白酶结构域保证蛋白酶和分子伴侣的活性，而PDZ1和PDZ2结构域还没有确定，尽管相信它们分别扮演将第五和蛋白分开和维持DegP六聚体结构的角色。DegP六聚体的晶体结构已经被证实，并且发现两个三聚体相互交错在一起，催化位点隐藏在中间空穴中，几乎不可能和底物接触。细菌的DegS和人类的HtrA2，这两个成员都缺少PDZ2结构域，在它们的三聚体形式中，活性位点都被周围的环和PDZ结构域阻塞。尽管很多努力，相互作用的六聚体和Htr

4、A三聚体是如何被激活的，还没有模型能够解释。这次研究的目的是阐述具有蛋白酶和分子伴侣活性的DegP的结构。我们结合生物化学和电子显微镜揭示DegP六聚体有效地转换为笼状结构寡聚体通过相邻的结合到底物上的三聚体对应的PDZ1PDZ2相互作用，这种寡聚体代表了一种能够表现蛋白酶和分子伴侣的的DegP的活性。这种活性调节方式允许DegP蛋白在没有与底物接触的时候能够保持没有活性的状态，这样能够防止蛋白的有害影响。这种蛋白酶活性机制，依赖于底物诱导的同源寡聚体的形成是可逆的，这和那些依赖于蛋白水解发挥活性的蛋白酶有很大的不同，这种活性激活方式是不可逆的。结论大复合物在DegP结合到底物蛋白时形成。蛋白

5、酶缺陷DegP分子（S210A）突变体，预计与基体的蛋白质形成稳定的中间体，这可能捕捉DegP分子的活性形式的某些功能。结果体积排阻色谱（SEC）（图1A）及十二烷基硫酸钠/页（图1B）分析揭示了一些存在同时含有DegP分子（S210A）和-酪蛋白或大型物展开溶菌酶（透过数码电视的待遇），最常见的两种用于分析蛋白质的蛋白酶活性基实验表明，DegP（22鈥。类似的大型复合物也观察当DegP分子（S210A）孵育DTT而减产-乳清蛋白或胰岛素（数据未显示）。这些大型DegP分子（S210A）基片尺寸为配合据估计，通过负染色电子显微镜（EM）的（图1C号），为14纳米（溶菌酶）和19纳米（与-酪蛋白

6、），而自由DegP分子（S210A）六聚体的估计是12纳米，用什么一致的估计是从晶体结构测定（12）。此外，这些形式的大型配合物进行了电磁研究也发现支持信息（四）图。反应混合物中一其中聚合未折叠蛋白被抑制的存在DegP分子（S210A）（25）。如此大规模的DegP分子配合物时，也发现野生型DegP分子是在42resorufin裂解标记的酪蛋白 C间只有很短的时间（5分钟）都被美国证券交易委员会和EM分析，（图一维）。如此庞大的结论是DegP分子复合物代表活动形式蛋白酶强烈支持以下几点：第一，大型复杂峰几乎完全消失后的潜伏期较长时间（120分钟）获得完整降解resorufin标记的酪蛋白（图一

7、维）;第二，resorufin标记绑定酪蛋白的分离大DegP分子复合物孵育后在42退化（右列图。1E）条。DegP蛋白在大复合物中以笼状形式存在，并且都是有三聚体单元组成。该DegP大分子的结构（S210A）-底物复合物随后通过分析冷冻电镜和单粒子重建。11998和7686的总颗粒图像（代表这显示在图。S2A和图。S2B）被用来重建DegP分子（S210A）-溶菌酶和DegP分子（S210A） - -酪蛋白复合物，分别实现了8.5A和9.7A（0.5傅立叶壳的相关性，如图。S2C公司）。结果中发现，他们为12聚体（四面体对称）或存在24聚体（八面体对称），都被笼在外观上像（图2A，图。S2D和

8、图。S2E）。三聚体进行的实验表明，DegP发现分布于笼状物的外壳，但约束基质蛋白（溶菌酶和-酪蛋白），这是预期将在位于腔，没有解析，有可能被平均出在重建过程中，由于其无序构象和/或缺乏对称性。最值得注意的是，尽管这些大DegP分子是不同的低聚物在规模，其三聚单元，每个单元被周围的邻居和其他三个三聚体相互作用每个并排的另一边，而不是面，面对什么实验表明，DegP六聚体的观察（图2B和图。三）。由于所有实验表明，DegP观察低聚物是由三聚单位，低聚态转换可能发生通过分离实验表明，DegP三聚体与重结合。这种机制的支持我们的实验表明，DegP六聚体的有效分离观察在高温和三聚体在降低重结合温度（图四

9、）。阻塞的活性中心由洛杉矶从相反的三聚体循环实验表明，DegP六聚体中的非活动（12）将被有效地去除作为解离结果事件。另一个显着特点是均匀分布外壳表面的洞有两种类型，这两种类型的洞：有4个在12-mers，每一个的直径是2nm并且被3个三聚体包围，8个在24-mers，每一个直径是4nm，被4个三聚体包围。每一个洞可能代表了底物蛋白的入口和出口途径，但是还需要进一步的研究来证明这个假设。原子模型揭示形成DegP 12- and 24-mers的三聚体的PDZ1PDZ2内部的相互作用。该实验表明，DegP三聚体结构，其提取的六聚体的晶体结构（PDB ID: 1KY9, molecule B co

10、nformation）（12），当时安装到大型寡聚体的重建模式。这种只允许一个操作蛋白酶域，但没有PDZ1和PDZ2域合身，暗示某些构象发生了变化，从转换大型低聚物六聚体。因此，蛋白酶，PDZ1和PDZ2域分别为模型拟合。一良好的重建模型之间的匹配和晶体结构，从而达到，这也提供了强有力的验证为我们的重建模式的高品质。对于例如，螺旋-螺旋E的和和结构片1-2结构特点可以很明显的在重构模型12-mer中发现(Fig. 2B and Fig. S5)。拟合结果显示，12 -和24-Mer的很类似的每个方面都在其他的结构三聚单位和三聚体之间的互动模式（图三A和B）。该PDZ1和PDZ2领域，虽然认为有

11、非常广阔的六聚体形式灵活（12），成为高度有序的，与一个三聚域PDZ1单位互动与邻近的三聚体PDZ2一个域名单位成对方式（示意图如图所示2C型）。几乎相同的跨三聚体PDZ1-PDZ2互动在这两种类型的大型低聚物显然成为可能由之间的距离变化的PDZ1和PDZ2每个亚基领域的12- 和24-因为该连接地区的高灵活性的性质。这种成对PDZ1-PDZ2相互作用成为可能是因为PDZ1和PDZ2的结构域发生从新定向。在12个碱基PDZ2结构域转移2纳米朝邻近的三聚体PDZ1域显然通过弯曲的柔性连接区域的PDZ1和PDZ2域（353残基，在图2D中的破折号）。因此，各PDZ2领域，通过C-末端链（残基440

12、-448，如图2E中26设计的），和邻近的三聚体PDZ1结构域相互作用。PDZ1结构域在同一时间经历了90度的旋转绕着精氨酸和甘氨酸残基（图2F）。这种成对PDZ1-PDZ2之间的相互作用是两个邻近的三聚体之间最明显的关联，它产生的头部到尾部圆环域的PDZ1和PDZ2内附大的孔低聚物（图六）。显然，PDZ1和PDZ2之间的相互作用在DegP寡聚体的聚集中扮演了最重要的作用。我们还注意到，对12和24-meric形式的蛋白酶PDZ1部分形式和三聚体的DegS蛋白酶三聚体的活性形式是高度相似的。（图2G）的（16，21）。在三聚体内部亚基之间的相互作用在不同的DegP寡聚体之间是明显没有变化的。而

13、三聚体之间的相互作用却是不同的。PDZ2结构域在DegP活性的调控中扮演重要的角色。SEC的结果显示，整个PDZ2域的移动（残基360-448），如DegP的突变蛋白（PDZ2），结果形成唯一的三聚体的形式，不是六聚体的12 -或24-聚体（图S7A）。这种突变的实验表明，不过DegP三聚体的形式同时展出伴侣样（图3A）和野生型的蛋白酶活性水平（图3b）与以前观察到的是一致的（13，26）。类似的研究表明，删除C端26肽段（残基440-448），这段肽段通过电子显微镜研究已经证实和邻近的PDZ1结构域相互作用（图2e的），并指定为突变DegP分子（B26），没有影响DegP六聚体的形成但是阻止

14、它转变为12和24-mers（图S7B）。不料，DegP分子（B26）突变体蛋白的表现显着较低的伴侣样（65为低，图。3A）及蛋白酶（50为低，图。3B的）活性。类似的减少蛋白酶活性也观察到从多个序列被截断的PDZ2域（图S8的）。这些意见实验表明，结构域PDZ2对DegP展现分子伴侣和蛋白酶活性的抑制作用。DegP蛋白酶的特殊活性展现了浓度效应。鉴于DegP分子蛋白质是活跃形式是其大型的寡聚形式，所以一个浓度效应预期应该存在。结果提出图3C认证（顶部曲线）显示，在8倍DegP分子浓度导致了2.4倍增加特定的蛋白酶活性。相比之下，没有任何浓度影响时发现DegP分子（PDZ2）和DegP分子（B

15、26），这是无法形成大的低聚物，和类似的分析相符（图3C）的。这种浓度效应是通过在存在增加量的蛋白活性缺失DegP蛋白的条件下检测确定量的DegP蛋白来检测的。引人注目的是，类似的浓度效果还发现（顶部曲线，图.3D）。这样一浓度的作用，但并没有检测时DegP分子（PDZ2）和DegP分子（B26），而不是野生型DegP分子蛋白质，进行了分析（图3D）。所有这些数据强烈支持我们推测，大DegP分子寡聚体蛋白酶活性形式。可以想象，这种浓度效应当在压力环境下DegP蛋白大量增加时表现出来（27）。大的DegP蛋白的聚合物在大肠杆菌的细胞提取液中检测出来。实验表明，DegP12的嵌合形式报道过（5，2

16、6，28），我们也证明出他们的存在，通过EM大肠杆菌细胞的提取物异源表达DegP分子（S210A）蛋白。在这项研究中，在电镜分析前，蛋白质纯化从细胞提取物经亲和层析分馏按尺寸排阻色谱（图4A）。显微照片呈现在图。4B和C都明确表明了存在12聚体和24DegP分子聚体在大肠杆菌细胞。讨论我们这里最重要的发现是，报告DegP六聚体蛋白在结合到底物蛋白后转变为12和24-mers。虽然12-mers在一篇更早的DegP的（5）研究中报道随后其他人也有了报道（15，26，28），我们的研究揭示了这种寡聚体的激活调节。这个发现不尽在了解DegP的激活机制方面有很大的进步，（12，29），而且也揭示了一个

17、在依赖于底物的蛋白酶激活可逆的独特机制。在我们的观察中，我们提出了一个工作模型（图5）解释如何DegP分子活化可能发生。简单地说，六聚体形式，通过实验表明，DegP三聚中间体，是可以改变的12聚体和24的蛋白质。在这个过程中，两两间的三聚体PDZ1-PDZ2是三聚体之间发生相互作用的单位，同时而优雅的消除PDZ2的抑制作用。作为一个结果，DegP分子蛋白转换为它的同时为蛋白酶和伴侣活动的积极形式。该基质蛋白，然后受到任何蛋白酶降解或折叠（13）。结束后，这种低聚物可能转换回其无效六聚体的形式，直到可再次被激活基质蛋白。这种通过同源寡聚激活机制，不同于以前的大多数提议。例如，DegS蛋白的激活是

18、通过肽段配给和它自己的单独PDZ结构域结合（16，19）。关于DegP分子被激活前的揣测主要集中于配体结合活性，以及如何封锁访问活性中心成为底物蛋白（20，21）。该机制将允许我们发现蛋白酶DegP分子的活动仍然直至惰性展开底物蛋白变得可用，这显然预示着细胞暴露在压力条件。DegP分子的功能，然后需要应付的环境条件。这样一活动调节的方法将避免潜在的有害实验表明，DegP蛋白酶活性的影响下压力的条件。我们认为，野生型DegP分子的三聚体的形式将只短暂存在，并立即转换成回无效六聚体或进入大经寡聚形式结合底物蛋白（如图所示。5）。根据我们的工作模式，这样的瞬时本实验表明，DegP三聚体形式很难展现蛋

19、白酶或伴侣活性，因为该PDZ2领域的抑制效果。这遵循的是，既充分展示PDZ2域截断活动。实验表明，DegP的12聚体和24聚体的笼状结构使人联想到他们的高度结构与GroEL和类比蛋白酶，充分研究的分子伴侣和蛋白质的降解机械分别为（30，31）。蛋白酶和对偶实验表明，DegP蛋白的功能表明，他们的伴侣在结构上的相似性不是巧合，而是进化的结果选择。我们的数据清楚地表明，12 -和24聚体的DegP分子组装都是通过类似的PDZ1和PDZ2域介导的相互作用方式（图2C）。这种相互作用模式将允许DegP分子的三聚体的单位组装成较大的笼状低聚物为60聚体在二十面体对称性。实验表明，DegP是否真的存在如此

20、大形式在一定条件下，他们可能有什么功能，值得进一步调查。鉴于DegP分子蛋白，位于在大肠杆菌细胞周质空间，一直认为发挥在折叠，膜外蛋白的迁移（32，33），这种超大寡聚DegP分子形式可能需要DegP分子的功能在大寡聚组装膜蛋白。关于DegP的结构和功能的没有答案的问题包括：什么决定DegP具有蛋白酶的功能还是分子伴侣的功能。蛋白的功能能够在大的寡聚体形式下重复还是需要经过重新接组装，重组装过程当每次它要行事功能的时候。重新折叠的底物蛋白是如何在大的寡聚物复合体中释放出来的？了解在细胞中的任何蛋白的功能和活动机制，什么事最明显相对最大的挑战。在提交这篇论文的时候，NATURE网路出版，报道了这

21、两个大的DegP的寡聚物的结构。主要有四种我们的研究结果之间的差异这里报告和报告人在Krojer等。首先，Krojer等确定了晶体结构的24嵌合形式，它显示出类似的PDZ1-三聚体之间的单位PDZ2相互作用。然而，结构12个嵌合形式确定只是在一个非常有限的由28A冷冻电镜，决议从他们建议之间的12聚体的三聚体的接触，通过单位PDZ1-PDZ1相互作用。相反，我们的高（8.5A）分辨率冷冻电镜的研究明确显示，相互作用调解这两个12聚体和24聚体的形成是相似，二者通过PDZ1-PDZ2相互作用，从而几乎相同战略实际上用于DegP分子形成两种类型的大型低聚物。第二，我们的结构为基础的突变和功能研究显

22、示，在PDZ2域显着的抑制作用对伴侣，蛋白酶的活性，这意味着一个优雅的机制通过PDZ2参与调解的形成大型低聚物同时消除其抑制作用对了蛋白酶分子伴侣活性。第三，我们观察到相关性高DegP分子浓度和较高的特定蛋白酶活性，也被加入观察到越来越多在蛋白酶缺陷突变DegP分子（S210A）浓度为系统包含一个野生型DegP分子固定数量，支持低聚物的概念，大都是活跃的形式。最后，我们的研究提供了重要见解的激活机制的蛋白酶。我们所提出的模型解释了一个机制，蛋白酶激活蛋白同源寡聚，这是底物诱导，更重要的是，在自然界可逆的。材料与方法试剂:镍NTA琼脂糖和beta-酪蛋白在Sigma购买，resorufin 标记

23、的酪蛋白来自罗氏，Amresco溶菌酶，酪蛋白和DTT从默克。其他试剂均为分析纯级。质粒的构建：野生型的degP基因通过PCR扩增插入到pET-28a表达载体中，一个6-组氨酸的标记别连接到C端。突变这个质粒，利用突变的质粒产生突变的蛋白。蛋白表达和纯化。在稳转的BL - 21（DE3）中大肠杆菌中表达异源蛋白DegP分子，质粒和其衍生质粒通过和亲和层析（13）纯化。简单地说，细胞生长在37的LuriaBertani培养基，在0.1mMisopropyl-1-thio-_-D-galactopyranoside的诱导下（在0.8 -1.0的A600）4 h后，离心在5000转10分钟。缓冲液（

24、缓冲液A）在净化使用的50mMNa2HPO4 -磷酸二氢钠，50毫米氯化钠，pH值7.6。细胞沉淀悬浮于当时的缓冲液A中，超声溶解，离心50分钟15000转。当时的上清液到2mlNi-NTA琼脂糖柱子，洗净，用200毫升缓冲液A（100毫升含0.5MNaCl和20mMimidazole另有100毫升含1MNaCl和20mMimidazole），然后用缓冲液洗脱被甲（含250毫米咪唑）。其纯度（95）分数经SDS / PAGE分析确认。SEC：SEC在4 。DegP-底物复合物的制备。要获得DegP分子底物复合物，纯化六聚DegP分子形式（S210A）（1.0毫克/毫升）加入底物蛋白折叠在摩尔比

25、1:2（DegP分子单体：底物）和42下孵育30分钟，离心去除聚集。DTT加入到溶菌酶中。实验表明，DegP瞬态而形成的大型复合物降解resorufin -酪蛋白。混合物0.16mgDegP蛋白和0.6毫克resorufin标记的酪蛋白在42孵育5分钟，分为两份，一份被立刻应用与SEC分析其他继续保持在42培养120分钟然后用于SEC分析。在574nm检测不同的光吸收值记录的洗脱曲线来检测在降解过程中包含resorufin标记的酪蛋白的形式的降解。电子显微镜和图像处理。负染色样品准备用1醋酸铀，然后飞利浦CM120影像BioTWIN透射电子显微镜以100千伏放大52000倍。DegP分子的（S

26、210A）底物复合物的冷冻样本使用装有4K4KCCDcameraFEIcryo电子显微镜照相。单颗粒DegP和底物复合物重建使用EMAN软件包（1.8版本）（35）以下程序中所描述的基本手册。简单地说，粒子从图像中手动提取的显微照片和CTF参数的确定我们利用ctfit程序仔细分析。相位校正图像，然后用来生成物内参平均值，随后被用于制作初始模型。该模型的对称性确定了试验和默认值，然后适用于以下投影匹配改进。模型反复提炼，直到在重建过程中再也不能改善。最终的重建模型Gaussianlowpass过滤，修饰和8.5（12个碱基）或9.7（24个碱基），分别显示的结构。该上的3 - D电磁晶体结构图进

27、行了拟合，随着Situs software软件包（36）上色。对这些图像重建和晶体结构，制备嵌合体使用加州大学旧金山分校方案（37）。光散射检测：混合物（400升）的DegP分子蛋白（0.1毫克/毫升）和溶菌酶（0.1毫克/毫升），含50 mM的磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，20毫升DTT，pH值7.6，分别置于42 石英试管。DegP分子在蛋白质预热42前加入到混合物。溶菌酶聚集通过测量与360纳米的光吸收。蛋白酶检测：实验表明，DegP的蛋白酶活性测定采用resorufin标记的酪蛋白为底物蛋白。一个50微升的resorufin标记酪蛋白0.4的水（重量/体积）中加入到150微升样品缓冲液（50

28、毫米的Tris - HCl，pH值7.6，含有DegP分子指定量），孵育42每5分钟，40-微升样本被移去，添加到96升为什5TCA终止反应，再经10分钟，37孵育，5分钟离心20,000g.上清升的样品80微升和合120微升的测定缓冲液混合（0.5MTris盐酸，pH8.8）在574nm处立即测量。具体蛋白酶活性可从计吸收曲线的线性范围的斜率中计算出来。致谢：我们感谢Jean Michel Betton（巴斯德研究所巴黎）提供pTdeg质粒; StevenLudtke（贝勒大学医学院，休斯敦），Hong-Wei Wang（加州大学伯克利分校，伯克利分校），YifanCheng（加州大学旧金山

29、分校，旧金山），Zheng Liu（沃兹沃斯中心，奥尔巴尼）有益的讨论，Peng Ge（加州大学洛杉矶分校，洛杉矶）和Xiaokang Zhang（加州大学洛杉矶分校，洛杉矶），他们在数据的处理帮助，Tom Kellie（北京大学，北京）的编辑帮助。这项工作由国家自然科学基金会NO.30330160/no。30670501（S.F.S.），NO.30570355/no。30670022（Z.Y.C.），NO. 30400069（Y.W.），中国国家国家重点基础研究基金会，NO.2004CB720005（S.F.S.），NO.2006CB806508/NO.2006CB910300（ZYC），美国国立卫生研究院GM071940（ZHZ），并为新世纪优秀方案人才，NCET-05 -0884（Y.W.）。