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1、版 生物技术与工程 第2讲 微生物的培养和应用 第2讲微生物的培养和应用考纲展示1.微生物的分离和培养2.某种微生物数量的测定3.培养基对微生物的选择作用考点一| 微生物的实验室培养1培养基(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)种类：液体培养基和固体培养基，二者的区别是是否添加凝固剂。(3)营养成分：主要营养物质：碳源、氮源、水和无机盐。其他条件：pH、特殊营养物质和氧气。2无菌技术(1)关键：防止外来杂菌的入侵。(2)不同对象的无菌操作方法(连线)：答案：bb、aa、b3制备牛肉膏蛋白胨固体培养基(1)计算：依据配方比例，计算配制100 mL的培

2、养基时，各种成分的用量。(2)称量：准确地称取各种成分。(3)溶化(4)灭菌(5)倒平板：待培养基冷却至50 左右时，在酒精灯火焰旁倒平板。4纯化大肠杆菌(1)菌落：由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。(2)纯化大肠杆菌的方法纯化培养原理：在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。纯化大肠杆菌的关键步骤：接种。常用的微生物接种方法有两种。a平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。b稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。5菌种的保存方法

3、(1)对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。(2)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。1选修1P18“旁栏小资料”，微生物的接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？微生物接种的核心是什么？提示：不是，微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种等方法，其核心是防止杂菌的污染，保证培养物的纯度。2如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体方法。(1)获得图A、图B效果的接种方法分别是什么？提示：稀释涂布平板法；平板划线法。(2)某同学在用A方法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？为了防止杂菌污染，有同学建议加入抗生素

4、，你觉得可以吗？并说明理由。提示：菌液浓度过高(土壤溶液稀释不够)。不可以，因为抗生素不但杀灭杂菌，而且也可以杀灭大肠杆菌，因此在培养基上不可以加入抗生素。1选择无菌技术的原则(1)考虑无菌技术的效果：灭菌的效果比消毒要好。(2)考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能灭菌。2纯化大肠杆菌的两种方法的异同(1)相同点：平板划线法和稀释涂布平板法都能获得单细胞菌落。(2)不同点：平板划线法不能对微生物计数，而稀释涂布平板法能对微生物计数。 考法1考查无菌技术1(2018全国卷)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：(1)在实验室

5、中，玻璃和金属材质的实验器具_(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是_。(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能_。在照射前，适量喷洒_，可强化消毒效果。(4)水厂供应的自来水通常是经过_(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是_。解析：(1)在实验室中，能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属材质的实验器具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)巴氏消毒法或高温

6、瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点表现为在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。(3)紫外线照射能消毒的原因是其能够破坏微生物细胞中的DNA分子。在利用紫外线照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可强化消毒效果。(4)自来水通常采用氯气消毒。(5)采用高压蒸汽灭菌时，若压力达到设定要求，而温度未达到相应要求，最可能的原因是没有排尽高压蒸汽灭菌锅内的冷空气。答案：(1)可以(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少(3)破坏DNA结构消毒液(4)氯气(5)未将锅内冷空气排尽 考法2考查微生物的纯化技术2(2014全国卷)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并

7、进行了细菌分离等工作。回答下列问题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为_。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过_灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_。(3)示意图A和B中，_表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀

8、，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中_的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高_的利用率。解析：(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取灭菌后的空白平板先行培养一段时间。0.1 mL稀释液中平均有(393837)/338个活菌，则每毫升稀释液中活菌的数目为38/0.1380，则稀释前每毫升水样中活菌数目为3801003.8104，则每升水样中活菌数目为3.81041 0003.8107。(2)接种环、接种针等金属用具可直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，以达到迅速彻底灭菌的目的。

9、在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)比较图A和图B可以看出：A培养基中细菌的分布呈线性，是用平板划线法接种培养后得到的结果；B培养基中细菌均匀分布，是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高了营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。答案：(1)检测培养基平板灭菌是否合格3.8107(2)灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落(3)B(4)溶解氧营养物质3某研究小组研究了不同浓度的抗生素A对大肠杆菌生长的影响，实验结果见如图

10、1。回答下列相关问题：(1)该培养基为大肠杆菌提供的主要营养物质有碳源、水、无机盐、_四类，而配置该培养基时，通常加入_作为凝固剂。(2)为了确保利用_法接种大肠杆菌时，形成一层菌膜，则对菌种的稀释倍数_。另外，在培养和接种大肠杆菌时要特别注意进行_操作。根据实验结果，选出对大肠杆菌抑制作用最明显的抗生素A浓度的依据是_。(3)为减少实验误差，每一浓度的抗生素A还要制备_。(4)该研究小组运用上述实验方法还研究了相同浓度的a、b、c三种不同抗生素对大肠杆菌生长的影响。请在图2中图示这一处理方案(可模仿图1加以必要的注解)。解析：(1)微生物生长繁殖所需要的四类主要营养物质是水、无机盐、碳源和氮

11、源。该实验所用的培养基为固体培养基，常用的凝固剂是琼脂。(2)图中接种大肠杆菌时所使用的接种方法是稀释涂布平板法，为了得到菌膜，稀释倍数不能太大。接种和培养大肠杆菌的关键是无菌操作。据图1分析，号圆纸片的抑菌圈最大，说明该浓度的抗生素A对大肠杆菌抑制作用最明显。(3)为减少实验误差，每一浓度的抗生素A还要制备多个圆纸片进行重复实验。(4)该方案的自变量为相同浓度的a、b、c三种不同抗生素，还应有空白对照，注意在图中要标记清楚，具体图解见答案。答案：(1)氮源琼脂(2)稀释涂布平板不能太大无菌透明圈越大，抑制效果越明显(3)多个圆纸片(4)图示见如图所示考点二| 微生物的分离与计数1筛选菌株(1

12、)寻找目的菌株的方法：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。(2)实验室中微生物的筛选：方法：人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长。实例：筛选尿素分解菌时使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养。(3)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。2统计菌落数目的方法(1)显微镜直接计数法原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品

13、稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。操作：设置重复组和对照组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。3土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养分解尿素的细菌。(2)原理 分解尿素的细菌 CO(NH2)2H2OCO22NH3 酚红指示剂变红色(3)实验现象及结论培养基变红：该种细菌能分解尿素。培养基不变红：该

14、种细菌不能分解尿素。(4)统计菌落数目统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。(5)实验流程土壤取样样品的稀释微生物的培养与观察细菌的计数。4分解纤维素的微生物的分离(1)纤维素酶组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。作用：纤维素纤维二糖葡萄糖 (2)纤维素分解菌的筛选原理 纤维素分解菌 红色复合物红色消失，出现透明圈。筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。实验流程：富含纤维素的环境 ：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度 ：制备系列稀释液 ：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养

15、基上 ：产生透明圈的菌落1选择菌落数时，若得到3个或3个以上菌落数在30300的平板是否一定正确？并说明理由。提示：不一定。如得到3个平板，菌落数分别为200、34、240，虽然菌落数均在“30300”，但由于34与另外两个平板上的菌落数差异较大，应找出原因并重新实验。2研究人员用含有刚果红的培养基培养纤维素分解菌时，筛选到了几株有透明降解圈的菌落如图所示。据图回答以下问题：(1)简述透明圈的形成过程。提示：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，形成透明圈。(2)推测与图中透明圈大小有

16、关因素主要是什么？降解纤维素能力最强的菌种是哪种？提示：纤维素酶的产量和活性。 菌落。1选择培养基的作用原理(1)在培养基中加入某种化学物质，如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在满足基本所需培养成分的基础上加入。(2)改变培养基中的营养成分，如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；以石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。(3)改变微生物的培养条件，如将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物，在高盐环境中培养可分离得到耐盐菌。2目的微生物选择的三种方法(1)利用平板划线法或稀释涂布平板法接种在固体平板培养基上，根据目的微生物

17、特定的菌落特征挑选目的微生物。(2)利用选择培养基直接筛选目的微生物。(3)利用鉴别培养基鉴别筛选目的微生物。 考法1考查微生物的选择培养1(2017全国卷)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生_。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_(答出两点即可)。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择_(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是_。(3)用来筛选分解尿素细菌

18、的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有_(答出两点即可)。解析：(1)有些细菌能分解尿素是因为这些细菌能产生脲酶，将尿素分解成CO2和NH3。能分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2作为碳源合成有机物，但这些细菌可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是：作为能源物质氧化分解为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择尿素作为唯一氮源，这样只有能分解尿素的细菌才能在培养基上生存。若选择“NH4NO3”或“尿素NH4NO3”作为氮源，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用。(

19、3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，它们可以为细菌生长提供无机营养；同时，KH2PO4和Na2HPO4还可以作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定。答案：(1)脲酶分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料(2)尿素其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定 考法2微生物的分离与计数2(2018全国卷)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定

20、量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制_的生长，加入了链霉素的培养基属于_培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有_(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有_(答出两点即可)。(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是_，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_。(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲

21、同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是_。解析：(1)在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。若M培养基是用于真菌的筛选，则应加入链霉素以抑制细菌的生长，其属于选择培养基。(2)马铃薯浸出液中含有淀粉、蛋白质、脂质、无机盐、水等多种物质，因此，除氮源外其中还有微生物生长所需要的碳源、无机盐等营养要素。进入细胞的氮源可参与合成蛋白质、核酸(DNA、RNA)等含氮的

22、生物大分子。(3)加入显色剂碘液后，淀粉遇碘变蓝，而淀粉的水解产物则不发生这种反应。若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，土壤中能产生淀粉酶的微生物可将淀粉分解，菌落周围就会出现透明圈，这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选能产淀粉酶的微生物了。(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，结果的重复性太差，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。答案：(1)细菌选择(2)碳源、无机盐蛋白质、核酸(3)碘液淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差

23、3为研究“某品牌酸奶中乳酸菌数量及其对抗生素耐药性情况”，某同学进行了如下实验。请分析回答下列问题：(1)配制的细菌培养基除了含有水、碳源、氮源和无机盐等主要营养成分外，还应加入适量的_和琼脂。在培养基各成分溶化与灭菌之间，要进行的是_。(2)接种微生物的方法有很多，图中过程所示的方法为_。用该方法统计样本菌落数后，所得数据需要乘以10n后，才可表示乳酸菌的数量(单位：个/mL)，这里的n_。用该方法统计样本菌落数时，同时需要做A、B、C三个培养皿，原因是_。(3)为了检测乳酸菌对抗生素的敏感性，取该单菌落适当稀释，接种于固体培养基表面，在37 培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。将

24、分别含有A、B、C三种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A_(填“敏感”或“不敏感”)；含C滤纸片周围的透明圈比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是_。解析：(1)配制的细菌培养基除了含有水、碳源、氮源和无机盐等主要营养成分外，还需要特殊的物质维生素，由于该培养基为固体培养基，因此还应加入适量的琼脂作为凝固剂。在培养基各成分溶化与灭菌之间，要先调pH。(2)接种微生物的方法有很多，图中过程所示的方法为稀释涂布平板法。用该方法统计样本菌数落时，同时需要做A、B、C三个培养皿，分别计数3次

25、，取平均值，使实验结果更加准确可靠。用该方法统计样本菌落数后，所得数据需要乘以10n后，才可表示乳酸菌的数量(单位：个/mL)，这里的n6。(3)在抗药性检验过程中，如果在含某种抗生素的滤纸片周围出现透明的圆圈，说明此种抗生素可抑制该细菌，因此该致病菌对抗生素A敏感；含C滤纸片周围的透明圈比含A的小，且透明圈出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素C的耐药菌。答案：(1)维生素调pH(2)稀释涂布平板法6分别计数3次，取平均值，使实验结果更加准确可靠(3)敏感抗生素C的耐药菌真题体验| 感悟高考淬炼考能1(多选)(2016江苏高考)漆酶属于木质素降解酶类，在环境修复、农业生

26、产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是()A生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品B筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落 C在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化D斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株答案：BC2(2016全国卷)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；制作无菌平板；设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；将各组平板置于37 恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。回答下列问题：(1)该培养基中微生物所需的氮来源于_。若要完成步骤，该培养基中的成分X通常是_。(2)步骤中，实验组的操作是_。(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_现象。若将30(即366