稳定的水溶性Fe3O4纳米粒子的制备及其表征.docx

1、稳定的水溶性Fe3O4纳米粒子的制备及其表征稳定的水溶性Fe3O4纳米粒子的制备及 其表征（作者： 单位： 邮编： ）作者：吴利清，张熙之，方芳，王怡红，张宇，顾宁【摘要】 目的：制备稳定的水溶性 Fe3O4纳米粒子（PMAT Fe3O4）磁共振成像（MRI）造影剂，并对合成的粒子进行表征。方法：利用高 分子聚；1 十四碳烯马来酸酐（PMAT修饰油溶性Fe3O4纳米粒子 表面，使粒子表面富含亲水性羧基基团，使粒子能够稳定存在于水相 中，并用透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）、振动样品磁强计（VSM） 傅立叶红外吸收光谱（FT IR）和MRI等方法进行表征。结果：（1） TEM 分析显示，

2、PMAT Fe3O4粒子直径约为10 nm, DLS测定其水动力学 平均直径约为80 nm;（2） PMAT Fe3O4粒子能稳定分散于去离子水、 PBS Tris、MES等缓冲液中，不发生团聚;（3） VSM MRI等分析手段 显示，PMAT Fe3O4的饱和磁化强度 Ma 14.0 emu g-1，弛豫率 r2=367.79 mM-1s-1。结论：PMAT Fe3O4具有良好的水溶性、磁学 性能和较高的r2值，有望发展成为一种性能优异的 MRI造影剂。【关键词】Fe3O4纳米粒子；表面修饰；聚合物；弛豫率Abstract Objective: To syn thesize stable a

3、nd water fl： soluble PMAT Fe3O4nanoparticles(NPs) as MRIcontrast age nt and characterize it. Methods: Poly maleic an hydride alt ：砥 1 g tetradecene(PMAT) was utilized to modify the surface of oil soluble NPs, and the obtai ned PMAT 霧Fe3O4 NPs were characterized by TEM, DLS, FT IR, VSM and MRI. Resul

4、ts: (1) TEM and DLS studies showed that the PMAT Fe3O4 NPs have a magn etic core size of about 10 nm and a hydrod yn amic diameter of about 80 nm.(2) PMAT %； Fe3O4 could keep stable in water and familiar buffers, such as MES, PBS and Tris without aggregatio n.(3) VSM measureme nts showed that the sa

5、turatio n mag netizatio n(Ms) was about 14.0 emu g-1 , the relaxivity value(r2) of PMAT ：援 Fe3O4 was 367.79 mM-1s-1. Conclusion: The obtained PMAT Fe3O4 NPs possess outstanding water ： solubility, good magnetic properties, and high r2 value, which are therefore expected to become an excellent MRI co

6、n trast age nt.Key words Fe3O4 nano particles; surface modificati on;polymer; relaxivity磁性纳米粒子(NPs)在生物技术和生物制药等领域已显示出良好 的应用前景1。氧化铁纳米粒子由于具有独特的磁学性质和良好的生物相容性，研究其作为造影剂在磁共振成像（MRI）技术方面的应用,已成为发展最为迅速和最为重要的课题之一。 其中，化学制备具有稳定水溶性和高弛豫率(r)的磁性氧化铁纳米粒子是一个重要的研究方 向。r的大小是考察氧化铁纳米粒子是否具有良好造影能力的重要参 数，它分为r1和r2两种,分别代表了单位浓度粒子缩

7、短体系内质子 弛豫时间T1和T2的效率2-4。本实验利用高分子聚 1十四碳烯马来酸酐(poly maleic an hydride alt 1 tetradece ne, PMAT)，对油溶性的油酸包覆的 Fe3O4纳米粒子(oleic Fe3O4进行表面修 饰，使其能够稳定分散于水相中，获得水溶性 Fe3O4纳米粒子(PMAT Fe3O4),研究表明，该种纳米粒子具有较高弛豫率 r2值，能 够作为良好的MRI造影剂。1材料与方法1.1材料PMAT(Sigma Aldrich)、透析袋(50 KDa)、oleic | Fe3O4(参照文献5报道，本实验室制备)。1.2主要试剂氯仿(上海市四赫化

8、工有限公司)，碳酸盐缓冲液(pH 10.8)、MES缓冲液(pH 6.0)、PBS缓冲液(pH 7.4)、Tris缓冲液(pH 8.0)(缓冲 液均为本实验室配制)，正己烷(上海市实德化学有限公司),去离子 水。1.3实验方法1.3.1 PMAT Fe3O4纳米粒子制备称取0.05 g oleic Fe3O4固体粉末和 0.2 g PMAT，分别溶于10 ml氯仿中，超声5 min后，室温下于50 ml烧瓶中混合搅拌反应4h。旋转蒸发除去溶剂氯仿，得到黑色固体。在氮气保护下，将黑 色固体加入30 ml碳酸盐缓冲液，50 C下在100 ml三颈瓶中剧烈搅 拌反应3 h，得到稳定的黑色水溶性 PM

9、AT Fe3O4纳米粒子。132提纯将以上PMAT Fe3O4纳米粒子用220 nm滤膜过滤后，置于磁场 下磁分离，待分层明显后，取下部磁性物质重新分散于 10 ml去离子 水中，用去离子水透析24 h，透析过程中换去离子水 3次，得到纯 净的分散于水中的 PMAT Fe3O4纳米粒子。1.3.3表征运用多种分析手段对所制备的粒子进行表征，研究其作为造影剂 的性能。1.331 Fe浓度测定 使用邻二氮菲分光光度法6对样品的Fe 浓度进行测定。制备了 3个浓度梯度的样品待测，其中 Fe含量比为 2 ： 1 ： 0，测得 Fe 浓度为 1.7 mg ml-1。1.3.3.2透射电镜（TEM分析 将

10、样品用去离子水稀释后，滴1滴 于TEM专用铜网上，40 C下真空烘干 8 h，待测。仪器型号为 JEM 200CX1.3.3.3动态光散射（DLS）分析 将样品用去离子水稀释至 Fe浓 度为0.5 mg ml-1后，室温下测定其水动力学粒度分布。仪器型号为 Malvern Zeta Size 3000HS。1.3.3.4傅立叶红外吸收光谱（FIR）分析取1 ml制备的PMAT Fe3O4溶液，以6 mol L-1盐酸调至等电点，析出的黑色固体用去离子水洗涤3次，40 C真空干燥，得到黑色固体粉末，待测。仪器型号 AVATAR 360FTIR133.5 振动样品磁强计（VSM）分析 制样同FT

11、IR。仪器型号 为 Lakeshore 7400 。1.3.3.6 MRI 准确配制 Fe浓度为 5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 卩 g ml-1 PMAT Fe3O4溶液，各取 1.4 ml 液体于 1.5 ml离心管中，待测。室温下，MRI实验磁场强度为7.0 T ,自旋回波 序列，脉冲重复间隔时间TR为2 500 ms回波时间TE分别为11.0、 22.0、33.0、44.0、55.0、66.0、77.0、88.0、99.0、110.0、121.0、 132.0、143.0、154.0、165.0 和 176.0 ms 仪器型号为 Bruker Pha

12、rma Scan, 7.0 T，孔径为16 cm,最大梯度强度为 300 mT- m-1。2结果2.1粒度分析使用PMAT修饰后，PMAT Fe3O4可以稳定存在于水环境中，包 括MES PBS Tris等缓冲液体系中。在4 C条件下，粒子可以长时 间保存不发生沉积。TEM分析显示，PMAT Fe3O4分散性良好（图1）, 这主要是由于粒子间的静电排斥作用和空间位阻作用的结果， 但是小的聚集体仍然存在。PMAT Fe3O4纳米粒子的直径约为10 nm,与油 溶性oleic Fe3O4相比，粒度并无明显改变。DLS分析显示，在水 环境中，PMAT Fe3O4的水动力学平均直径约为 80 nm（图

13、2），明显 高于TEM测得的尺寸，这可能有两个原因：（1） DLS统计的是纳米粒 子在水环境中的整体尺寸，包括表面有机物壳层和水化层对粒径大小 的贡献，而修饰在粒子表面的有机物分子包裹层并不能在 TEM图中显 示出来;(2)有几个Fe3O4纳米粒子被PMAT包裹成一个整体，形成一 个相对较大的PMAT Fe3O4粒子，影响了粒子的整体尺寸分布。 a. oleic Fe3O4; b. PMAT| Fe3O42.2 FT IR 分析通过对粒子红外图谱的分析，可以获得粒子的化学结构信息，见 图3。a和b曲线中，2 850 cm-1和2 930 cm-1的吸收峰表明粒子 中存在大量的甲基与亚甲基基团，

14、同时，由于大量有机聚合物 PMAT的存在，PMAT Fe3O4中 Fe O伸缩振动吸收峰(593 cm-1)的强度7 并不如oleic拟Fe3O4高;b曲线中，1 707 cm-1的吸收峰表明体系中 大量羰基(C=O)的存在，这是由于大量酸酐水解产生羧基所导致，同 时a曲线的羰基吸收峰很不明显。PMAT Fe3O4纳米粒子表面羧基所 带负电荷是其能够稳定分散于水环境中的原因之一。a. oleic Fe3O4; b. PMAT Fe3O42.3磁性分析磁滞回线显示，oleic Fe3O4的饱和磁化强度 Ms为57.0emu- g-1 , PMAT Fe3O4的饱和磁化强度 Ms值约为 14.0

15、emu g-1 , 见图 4。a. oleic ； Fe3O4; b. PMAT Fe3O4由图 4 可见，修饰后 Ms 值下降了很多，这可能是由于受到粒子表面较厚的有机修饰物的影 响，尽管如此，还是能够满足常用的生物应用要求，很多报道证明了 这一点8-9。修饰前oleic Fe3O4的矫顽力为0.183 Oe ,修饰后只有微小改变，为0.141 Oe,很接近于0,说明Fe3O4磁核具有良好 的超顺磁性10-11，适合作MRI造影剂。超顺磁性是指磁性粒子尺 寸小于某一临界尺寸时，表现出矫顽力为零，室温热即能够克服磁各 向异性使磁矩能够任意翻转的状态。 当存在外磁场时，超顺磁性粒子 能够被迅速磁

16、化，表现出较强的磁性，一旦撤去外磁场，则磁性消失， 表现出平均磁化强度为零的状态12。r是反映磁性粒子磁学性质的重要物理量，是粒子作为造影剂的重要参数，定义为单位浓度(mmol L-1)活性离子所导致的水溶液弛 豫速度的增加。r的确定需要测量样品在不同浓度时的弛豫时间 T。T又分为T1和T2, T1为纵向弛豫时间，又称自旋丨晶格弛豫时间，T2 为横向弛豫时间，又称自旋 自旋弛豫时间13。以测定氧化铁纳米 粒子r2为例。一般地，MR信号强度(SI)可表示为： SI=S0(e TE/T2)(e TR/T1)，式中TR为重复时间，TE为回波时 间，S0是常数。当TR趋于无穷大，1 e TR/T1项接

17、近1,所以可 排除T1的影响。假设TR远大于T1 ,上述方程可简化为： SI=S0(e TE/T2)，将方程两边取对数，得：ln(SI)=ln(K)-TE/T2 ,通过测量不同回波时间的 MR信号强度并根据计算公式进行指数拟合，可得到不同浓度材料的T2值。PMAT Fe3O4在不同Fe浓度下测 得的T1和T2值见表1。表1 PMAT Fe3O4纳米粒子弛豫时间T与Fe 浓度关系T2与T1相比，其值远小于T1,且梯度关系明显；经过线性模拟 计算，r1=0.34 mM-1s-1, r2=367.79 mM-1s-1,r1 远小于 r2。对于氧 化铁纳米粒子，r表示含有1 mmol - L-1 Fe

18、的水溶液相对于纯水的弛豫速度的增加，可表达为下式： 1/T1=1/T1(Fe=0)+r1Fe;1/T2=1/T2(Fe=0)+r2Fe 。式中 1/T为样品弛豫时间的倒数，即弛豫速度；1/T(Fe=0)为Fe浓度为0时 的弛豫速度，即纯水弛豫速度;Fe为样品体系中Fe的浓度。以弛豫 速度(1/T1 , 1/T2 , s-1)作为Fe(mmol -L-1)函数，绘制线性拟合图， 拟合直线的斜率即为所测粒子的r，见图5。结果显示，PMAT Fe3O4 具有较高的r2，为367.79 mM-1s-1，而其r1值则十分小，约为0.34 mM-1s-1，说明其可作为良好的T2造影剂。将PMAT Fe3O

19、4纳米粒子作为T2阴性造影剂所得MRI图像，见 图6。磁场强度为7.0 T，实验环境为室温，TE=66.0 ms。由图6可 见，信号强度从强到弱，Fe浓度分别为0.156 25、0.312 5、0.625、 1.25、2.5、5卩g - ml-1，可以看出，作为阴性造影剂，随着 Fe浓 度的升高，PMAT Fe3O4的造影能力增强，梯度变化明显，与其高r2 值相对应。图5 PMAT Fe3O4弛豫速度与样品Fe浓度关系3讨论用来修饰纳米粒子的分子种类很多，常见的有无机分子，如Au2、Si14等；有机小分子，如二巯基丁二酸(DMSA)15等；而有 机大分子由于其良好的生物相容性和来源广泛，亦得到

20、了广泛的应 用，常用的有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)佝、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)17 等。修饰物连接于Fe3O4纳米粒子表面的机理可以分为两种基本模 式，第一种是表面修饰物非共价吸附，即修饰后修饰物与纳米粒子表面并不形成新的共价键，修饰物通过非共价键连接在纳米粒子表面， 主要作用力有范德华力、疏水作用、静电吸附等，这种方式主要应用 于一些具有较长碳链的有机大分子修饰， 静电力与空间位阻都对修饰 后粒子的稳定性具有积极作用；第二种是修饰物改变，即新的修饰物 将纳米粒子表面已有的修饰物取代，新的修饰物与纳米粒子表面以共 价键相连接，这种方式可以在粒子表面引入目标分子， 也可以取得良好的效果18-19

21、。PMAT是一种两亲性聚合物，其中疏水烷基链可能是以疏水作用 非共价吸附并包裹于oleic Fe3O4表面，即采用上述的第一种模式，使纳米粒子表面富含亲水性官能团羧基。 PMAT大分子所提供的空间位阻和羧基所带有的负电荷（静电作用）是PMAT Fe3O4粒子能够稳 定存在于水相中的两种主要作用力。经过修饰后， PMAT Fe3O4纳米粒子可以稳定分散于水相中，包括 MES PBS Tris等缓冲液体系， 且能长时间保持稳定，不发生团聚，同时， PMAT Fe3O4具有较高的r2，为367.79 mM-1s-1，提示其可作为一种潜在的 MRI造影剂。作 为对比，本实验测定了相同条件下市售产品 F

22、eridex20的r2，约为 221.69 mM-1s-1，远比 PMAT Fe3O4的 r2 值小。影响磁性纳米粒子r大小的因素有粒子的饱和磁化强度、晶体组 成成分、晶格形式、尺寸大小和粒子优化修饰等。已有研究报道，较 大的粒子尺寸和粒子的聚集均会提高粒子 r1。本实验中，晶体组成成分和晶格形式都不会发生变化，但是PMAT Fe3O4磁核的粒径比 Feridex相对较大，且通过观察TEM电镜图，可以发现会有2-3个粒 子被聚合物包裹在一起，形成稳定的聚集体，即增大了粒子的尺寸分 布，所以，PMAT Fe3O4相对较高的磁性粒子尺寸分布直径导致了其 较高的r2，而高r是纳米粒子具有优良造影剂能

23、力的重要参数。本实验采用PMAT修饰油溶性oleic . Fe3O4纳米粒子，修饰后PMAT Fe3O4纳米粒子能稳定分散于水相中，具有较高的r2，可以作 为优良的T2阴性MRI造影剂。【参考文献】1JUN Y W, LEE J H, CHEON J. Chemical design ofnan oparticle probes for high 瀕 performa nee magn etic resonanceimagi ngJ. An gsw Chem Int Ed En gl, 2008,47(28):5122 5135.2SUNG J C, BENJAMIN R J, ANGELIQ

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