第八章重组DNA与现代生物技术doc.docx

1、第八章重组DNA与现代生物技术doc第八章 重组DNA与现代生物技术第一节 农业生产中的应用转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面.1.抗虫转基因植物2.抗病转基因植物 3.其他抗逆转基因植物抗除草剂抗冻番茄 4.利用转基因改良植物的品质转基因赖氨酸玉米变色矮牵牛基因工程在农业上的应用：1）高产、稳产和具优良品质的品种 用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。如“转基因高赖氨酸玉米”植株。 2）抗逆性品种 将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高寒等抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。如转基因抗虫棉。 第二节 重

2、组DNA与药品生产美国批准上市的基因工程药品有人类胰岛素、人类生长因子、白介素、干扰素、牛型生长激素疫苗等。我国自1986年“863”计划实施以来，至2000年已有15种基因工程药物，3个基因工程疫苗和数十个重组诊断试剂投放市场。人用蛋白质药物传统生产的弊端： 成本高；产率和产量低；原料易污染，不安全。 基因工程药物可以克服传统方法生产蛋白药物的困难，原因： 可解决蛋白药物的产量问题，只需生长旺盛的表达系统；微生物容易大量培养，能够降低成本；基因工程生产人源的蛋白质药物安全、有效；通过基因工程队编码基因改造以改造蛋白质结构，使之更稳定，活性更高，副作用更低。基因工程药物生产的主要步骤一、分离编

3、码蛋白药物的DNA或cDNA：提取蛋白，纯化，测部分序列，推测编码序列，合成探针，从文库中筛选基因； 用已经纯化的蛋白质制备抗体，然后从表达文库中筛选二、优化基因表达的条件： 表达蛋白的功能； 表达量的多少一、人生长激素的生产 人生长激素（hGH）是脑下垂体前叶分泌的蛋白质类激素，对人体除神经组织以外的所有组织（包括骨骼、肌肉、结缔组织、毛发和皮肤等）都有促进生长的功能。间接地还能促进脂肪和糖类的降解，增强蛋白质和核酸的合成作用。近年来的研究发现，生长激素在治疗侏儒症、烧伤、肥胖、出血性溃疡及在维持肌肉的活力、改善心脏功能、延缓衰老、防治骨质疏松、促进伤口愈合等方面均具有重要的作用。此外，对免

4、疫系统也具有一定的增强作用。 以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。 1979年，人类首次利用基因工程技术在大肠杆菌中表达了人的生长激素，1985年美国FDA首先批准了重组人生长激素上市。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。 应用DNA重组技术，在大肠杆菌中表达人生长激素，有两条不同的技术路线“其一是生产胞内型的重组人生长激素；其二是生产分泌型的重组人生长激素。技术关键是：构建能够在大肠杆菌细胞中表达人生长激素的表达载体二、影响我国生物制药产业发展的因素1.研发投入 国外：23亿美元/基因药物 国内：10多年来，对

5、生物制药的总投入仅有40多亿元 2.投融资与产业化模式 国外：政府、企业、科研院所三位一体，大、中小企业结成战略联盟 国内：政府、企业、科研院所各自为政或偶尔两两结合，投融资机制不健全3.市场竞争环境 国外：市场竞争激烈，但秩序较好，市场份额 多为大公司所垄断 国内：仿制与重复建设、重复生产现象非常严 重，出现了一哄而上的过热现象，市场恶 性竞争，无法实现规模效益4.产品信誉 国外：产品信誉较好 国内：产品信誉低，“出现信洋不信中，买洋不 买中”现象5.创新与知识产权 国外：创新意识高，特别注重知识产权（主要 是专利、商标）保护 国内：创新意识低，严重缺乏自主知识产权产品，当前，我国已产业化的

6、21种基因工程药物和疫苗中只有3种拥有自主知识产权，其他均为仿制产品第三节 蛋白质工程所谓蛋白质工程，就是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。基本内容包括：一、按实际要求，周密审慎地设计新型蛋白质的氨基酸序列结构；二 、通过基因克隆等程序，在适当的寄主细胞中表达比天然蛋白质结构和特性更加优良的新型蛋白质；三、分离纯化符合商业标准的新型蛋白质目前，主要集中在改造现有蛋白质这一领域。一般步骤：（1）分离纯化需改造的目的蛋白（2）对纯化的蛋白进行氨基酸测序、x射线晶体衍射分析、核磁共振分析等。3）通过蛋白结构设计核酸引物或探针，从文

7、库中获取编码该蛋白的基因。（4）设计改造方案并进行改造基因序列。（5）把改造的基因片断插入适当的载体，表达产物。（6）分离纯化产物并进行功能检测。一、定点诱变策略定义：指在DNA水平上改变氨基酸的编码序列。 实施前提： 要改变的基因编码区精确的核苷酸序列 要引入的氨基酸变化1. 用M13DNA进行的寡核苔酸介导诱变这是进行定点诱变最常用的方法，利用了M13噬菌体生活周期中单链形式的存在。由于技术上的原因，采用这种方法通常只有I一5的噬茵斑含有突变的基因。因此，人们又对它做了各种改进。改进的用M13DNA进行的寡核苷酸介导的诱变2. 寡核苷酸介导的PCR诱变此方法不用把基因克隆到M13载体上，也

8、不用为了提高突变率而使用dut-、ung-系统，而且不用将M13上的突变基因再亚克隆到表达载体上。但是需要合成两对引物。3. 改进型双引物诱变把PCR技术应用于M13噬菌体上进行基因诱变。 这种方法较为简便易行，且得到突变体的机率较高，因此是现在较常用的一种获得突变体的方法。4.重叠延伸诱变以线性DNA为模板，进行两次PCR。1.5 简并寡核苷酸引物如果不知道要将原来的氨基酸突变为哪一种新的氨基酸，那么人们通常都采用在一点引入突变，产生所有可能的氨基酸的方法。这种方法有两个优点：不要求知道特定氨基酸的功能；可能有意想不到的收获。1.6 随机诱变随机诱变就是在突变位置上随机地引入一种突变。缺点，

9、即对每一个克隆都需要检测其蛋白的活性，找到所需蛋白后，再对其基因进行测序，只有这时才能确知是哪一个核苷酸发生了突变。寡核苷酸介导的基因突变应注意的各种因素（1）关于单链DNA模板的制备（2）关于寡核苷酸突变因误的设计和选择：a.引物尽可能避免重复序列及形成稳定的二级结构；b.引物突变碱基的两侧有足够长的互补序列；c.选用的寡核苷酸突变引物不能与载体上其他未点形成稳定杂合体；（3）关于突变引物与模板DNA的退火和引物延伸的条件：a.突变引物与模板DNA的比率；b.延伸反应（4）关于DNA聚合酶的选择二、定点诱变在蛋白质工程中的应用人们对酶、对蛋白质进行改造，目的是使它们更适合于工业生产。 提高蛋

10、白质的稳定性是工业生产中很重要的课题。一般来说提高蛋白的稳定性包括以下几个方面： 延长酶的半寿期； 提高酶的热稳定性： 延长药用蛋白的保存期； 抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。 1.提高T4溶菌酶的热稳定性理论上，在没有二硫键的蛋白分子中导入二硫键可以提高蛋白热稳定性。在T4溶菌酶中只有两个半胱氨酸（Cys54和Cys97），但这两个半胱氨酸不能形成二硫键，经三维分析发现，第3位的异亮氨酸与第97位的半胱氨酸距离非常近，所以把异亮氨酸突变为半胱氨酸。2.对干扰素（IFN）的改造人的干扰素（IFN）的cDNA在大肠杆菌中表达，产物的抗病毒活性为106U/mg，只有天然糖基化蛋白的10%，而

11、且虽然合成的干扰素量很多，但多数以无活性的二聚体形式存在。人们分析发现，IFN有3个Cys，因此推测可能形成了不正确的二硫键。根据已知结构的类似蛋白IFN，其分子中Cys29和Cys138形成了二硫键，该位置与IFN分子中Cys31和Cys141位置类似，所以推测IFN分子中的另一个Cys17可能带有游离的巯基，于是把它突变为Ser。3.改进1抗胰蛋白酶1抗胰蛋白酶是一种在肝脏中合成后被释放到血液的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其生理功能是保护组织免受弹性蛋白酶的消化作用。弹性蛋白酶是由嗜中性白细胞分泌的一种产物，可对肺造成损害，甚至发展成肺气肿。健康人体中，当1抗胰蛋白酶通过与弹性蛋白酶发生不可逆的结

12、合，便会在其358位的甲硫氨酸和359位的丝氨酸间被切割，同时使后者活性受到抑制，经过这种切割后，复合物便难以解离，从而通过血液排出体外。1抗胰蛋白酶358位的甲硫氨酸非常容易氧化成甲硫氨酸亚砜，氧化后由于分子过大无法嵌到弹性蛋白酶的活性部位，失去了结合能力。应用定点诱变技术把1抗胰蛋白酶的第358位的甲硫氨酸置换成缬氨酸，便可获得抗氧化的1抗胰蛋白酶突变。4.组织型纤溶酶原激活剂的改造组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是人体各种组织均可合成的一种丝氨酸蛋白酶。它能切割纤溶酶原形成纤溶酶，来分解血栓。所以重组的人tPA在临床上用作溶栓剂。天然的tPA半寿期仅有5分钟，在治疗中难以持续地发挥药效。作

13、为一种糖基化蛋白，很容易为肝脏受体所特异识别，于是将其分子中120位的天冬酰胺换成谷氨酰胺，半寿期大大延长。5.对其他的定点改造a. 改变酶的活性b. 对水蛭素的改造c. 对人的生长激素的改造d. 胰岛素的蛋白质工程第四节 抗体工程哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统保护自己不受有毒物质和病原物的侵害，其中一部分防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白，这些蛋白可以在其他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白，就是抗体(antibody)；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为抗原(antigen)。抗体：由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类与相应抗原

14、特异性结合，具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白IgG的基本结构图抗 体 分 子 的 酶 切 片 段一、抗体的结构一个抗体分子(即免疫球蛋白)通常包括两个完全相同的轻链分子(L)和两个完全相同的重链分子(H)，这4条链在氢键和二硫键共同作用下连在一起，形成一个“Y”字型结构。可变区（V区），恒定区（C区）二、抗体的功能Fab片段保存有抗原结合活性和特异性，与Fab片段不同，Fc片段没有抗原结合活性，但它是抗体结合上抗原后激活机体免疫反应的主要部位，它主要激活以下免疫反应：激活补偿功能系统，该系统可分解细胞膜，激活巨噬细胞，并且产生信号以激活免疫反应系统的其他组分。产生抗体依赖性细胞介导毒性（ADC

15、C）。Fab区域结合一个可溶性抗原后，抗体的Fc部分可结合巨噬细胞的Fc受体，使巨噬细胞吞食并毁灭抗原抗体复合体。三、单克隆抗体抗原决定簇：抗原的某些部分，比大分子小得多的有特异性的化学基团，有的仅有6、7个氨基酸组成。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。单克隆抗体：由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗体。1. 杂交瘤细胞系的产生注意：在制备单克隆抗体时，提供骨髓瘤细胞的动物和进行免疫反应制备B细胞的动物最好来自同一品系。筛选标记:HAT培养基；次黄嘌呤鸟嘌

16、呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）选择系统2.杂交瘤细胞的鉴定收集培养基加到另一个预先包埋好目标抗原的培养板上，清洗，加入二抗，通常在二抗上连有一个酶，可使一种无色底物变成有色物质，如果某个培养孔出现了颜色，就说明该培养基中含有对抗原特异的抗体。三、单克隆抗体的改造及应用人们可以利用杂交瘤技术连续生产纯化的单克隆抗体，抗体现在已被人们视为是一种有效的药物。面临的问题：交叉反应产生免疫反应及过敏反应 。现在的目标是获得高药效低免疫性的人类单克隆抗体。1.单克隆抗体靶向制剂靶向制剂：指借助载体、配体或抗体将药物通过局部给药、胃肠道或全身血液循环而选择地浓集于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞内结构的制剂。制

17、备单克隆抗体靶向制剂的方法主要有三种 a.药物与抗体直接交联 b.药物通过小分子交联剂与抗体连接 c.药物通过大分子载体与抗体相连2.杂交人鼠单克隆抗体鼠源单克隆抗体临床应用中会引起人的抗鼠反应，产生人的抗鼠抗体（HAMA）,于是构建嵌合抗体。嵌合抗体(chimeric antibody)从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。3.人源单克隆抗体a. 分离出产生特殊抗体的人B细胞，用病毒转化使之可以培养生长。b. 把人源免疫干细胞导入缺失大部分免疫

18、细胞的小鼠体内，使之产生人源抗体。c. 将改造过的人的抗体基因导入鼠胚胎系中以得到能生产人抗体的转基因鼠4. 抗体酶（Abzyme)概念：抗体酶或催化抗体（Catalytic antibody)是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。抗体酶的制备： a.使用与过渡态结构相类似的半抗原通过杂交瘤技术产生抗体酶。 b.定向催化。 c.对抗体进行化学修饰，使之与催化基团相连。5.单链抗体单链抗体：用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重

19、组蛋白。 特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。不易引起人体的免疫排斥，渗透性好。可用来构建双功能分子。单域抗体：仅由单个抗体可变区域构成的功能性抗体。一般只指单个VH功能区域。四、抗体的表达系统1.在重组噬菌体中筛选生产抗体 用杂交瘤细胞生产抗体，杂交瘤细胞在培养基中生长相对较为缓慢，同时培养杂交瘤细胞需要复杂且昂贵的培养基，因此使单克隆抗体技术受到了严重的阻碍。所以人们尝试用重组菌为生物反应器来生产单克隆抗体。 a.组合抗体文库b.随机多肽文库又称人工合成抗原决定簇文库，原理： 人工合成编码随机肽段的基因，克隆到丝状噬菌体中表达多肽于噬菌体表面，构

20、建成一个多肽文库，再通过特异免疫结合反应，从文库中筛选出能模拟某些生物大分子生物功能与活性的短肽小分子。c.目的基因噬菌体抗原决定簇文库与随机多肽文库原理相似，只是在获取编码随机多肽的基因时，不是随机合成，而是通过DNA酶降解一个特定的基因片断形成随机的DNA片断。2.在植物中生产抗体用植物生产抗体有其独特的优越性：一、可用于大规模的大田种植，价格低廉；二、外源基因一般都可以整合进植物的染色体中并稳定遗传；三、转基因植物株系可以通过种子形式长期保存；四、属于真核细胞，对表达的重组蛋白进行正确的加工和修饰。第五节 重组DNA与医学人类的疾病原因内在因素（主要是遗传因素） 外在因素（环境因素） 外

21、在因素+内在因素疾病的分类1. 由环境因素决定的疾病2. 由遗传因素决定的疾病3. 由遗传因素和环境因素共同作用引起的疾病囊性纤维病变:是一种严重隐性基因遗传病. 其特征是频发的呼吸道感染、呼吸困难和最终造成永久性的肺部损伤。糖尿病:糖尿病分1型糖尿病（type 1 diabetes）和2型糖尿病(type 2 diabetes)和妊娠期糖尿病（gestational diabetes）。其中1型糖尿病多发生于青少年，其胰岛素分泌缺乏，必须依赖胰岛素治疗维持生命。2型糖尿病多见于30岁以后中、老年人，其胰岛素的分泌量并不低甚至还偏高，病因主要是机体对胰岛素不敏感（即胰岛素抵抗）。 妊娠期糖尿病

22、（gestational diabetes）是源于细胞的胰岛素抵抗，不过其胰岛素抵抗是由于妊娠期妇女分泌的激素（荷尔蒙）所导致的。妊娠期糖尿病通常在分娩后自愈。AIDS: 艾滋病，即获得性免疫功能丧失综合症，英语缩写AIDS的音译, 是人体注射感染了“人类免疫缺陷病毒”（HIV - human immunodeficiency virus）所导致的传染病。一、疾病的诊断现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法来对病原物质进行诊断检测。有效的诊断方法都应该具备以下3个条件： 专一性强； 灵敏度高 操作简单 1.酶联免疫吸附 a.酶联免疫吸附的原理ELISA通常的检测过程包括以下几个步

23、骤 ： 将待测样品结合在固体支持物上； 加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗，反应后冲洗，洗去未结合上的一抗；加入二抗。二抗通常只特异地识别一抗，而不识别目标分子。二抗上还联着一种酶，这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有色物质。一抗与二抗反应完成后，再次冲洗掉未与一抗结合的二抗； 加入无色底物b 酶联免疫吸附的局限性酶联免疫吸附测定法需要一抗有高的特异性，来提高酶联免疫吸附检测的准确度，才不至于造成假阳性，因此酶联免疫吸附检测只能够作为一种初步的检测手段，要进一步确诊，还必须进行western检测。2.DNA诊断（gene diagnosis） 人类疾病的发生，除人体内的内源基因

24、的突变外，还涉及到外源性基因的入侵，各种微生物、病毒和寄生虫感染机体，都会造成特异的外源基因引发疾病，所以，通过基因分析，找出内源基因的异常和发现外源基因，从而快速、敏感地诊断有关疾病，这就是基因诊断的目的。利用基因探针、PCR等技术直接探查基因的存在和缺陷，对人体状态和疾病作出诊断，称为基因诊断或DNA诊断。基因诊断的目的物主要是DNA，其次也包括基因的转录产物mRNA。基 因 诊 断 的 特 点针对性强 以探测基因为目标，属于“病因诊断” 特异性高 以分子杂交技术为基本原理 灵敏度高 基因探针带有十分敏感的检测标记，待测标本微量 适应性强 基因探针可为任何来源，任何种类；探针序列可为已知亦

25、可未知，检测目 标可为特定的基因或基因组合，可为内源基因亦可外源基因，诊断范围广a. 核 酸 杂 交核酸杂交是DNA诊断分析方法的一种，其工作原理是两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成氢键。通常核酸杂交的检测过程主要包括以下几个步骤： 将单链目的DNA结合于膜上； 加入单链、标记过的探针DNA ，在一定的温度条件和离子浓度下使探针分子与目标DNA分子碱基配对； 冲洗，洗去多余的未结合的标记探针DNA； 检测探针和目标DNA形成的杂合分子； 杂 交 探 针 用作杂交的探针应该是高度特异性的DNA或RNA片段，也就是说，探针DNA或RNA必须只与持定的目标DNA序列杂交。杂交探针的分离:提取病原

26、微生物染色体的DNA；酶解；克隆进质粒载体，构建质粒文库；与病原微生物和非病原微生物的核DNA进行杂交；对有杂交信号的重组质粒的插入片段作进一步确定，并筛选。 非同位素标记杂交探针原理：通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的。非放射性检测系统的优点：寿命长，利于保存；灵敏度高；操作简便，用时短；安全性好。用生物素标记的杂交探针进行杂交的过程： 将生物素标记的探针与目标DNA杂交； 加入抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白； 加入一种经生物素标记的酶； 加入生色或化学发光的底物，然后根据颜色变化或化学发光来检测杂交的结果。b. 疟疾的分子诊断传统的检验方法：对抽取的血样

27、进行显微镜检查。酶联免疫反应检测：无法区别感染过疟原虫的患者和正在感染者。DNA杂交诊断：检测的是带有DNA的疟原虫，而不是疟原虫的蛋白或其抗体。前提是：分离杂交的探针。3.遗传疾病的分子诊断技术对于遗传疾病上DNA诊断分析主要是针对产前诊断以及症状发生前的早期诊断，以防止出生缺陷来提高人口质量。a. PCR酶解鉴定此法应用的条件： 突变位点恰好位于一个限制性内切酶位点b. PCR/OLA鉴定它是把PCR同寡聚核苷酸连接分析(oligo-nucleotide ligation assay,OLA)结合起来的一种检测方法。本质：分辨两个寡聚核苷酸探针是否实现了连接确定X和Y两条探针是否实现了连接

28、： 在探针X的5端标记上生物素，在探针Y的3端标记上地高辛； 杂交和连接后，变性DNA,释放探针，转至链霉抗生物素蛋白的小孔中，冲洗； 加入连接有碱性磷酸酶的抗DIG的抗体，冲洗； 加入无色生色底物c. 连接酶链式反应（LCR）鉴定注意：两个引物量要大大过量；杂交系统中要加入一种耐热的DNA连接酶。d. PCR-ELISA检测在PCR扩增以后，在酶标板上借用酶联免疫吸附试验（ELISA）的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现定量。被称为PCRELISA。 e. 同一基因中多个不同位点的突变的检测多数情况下，基因内的许多不同的位点都有可能发生突变，而每个突变可能导致同一种遗传疾病。这样只检查一

29、处核苷酸的突变是不够的，但是对各突变点依次检查太繁琐，费用也太高。特异性等位基因寡核苷酸杂交（ASO）原理：对待测样品进行PCR扩增反应之后，扩增产物分别与生物素标记的野生型寡核苷酸探针和突变型寡核苷酸探针在严格条件下进行杂交，根据杂交带的强弱来判断是否有突变发生。 扩增阻滞突变系统（ARMS）人工引入酶切位点（AIRS）又名限制性内切酶位点引入PCR。原理：在突变位点引入一错配碱基，从而引入一个新的酶切位点，以便对突变体的检测。直接测序法（DS） DS法是将测序技术与PCR技术相结合而形成的一种检测方法，利用这种方法，PCR产物无需经过克隆就可进行测序。一般是通过不对称PCR法获得用于测序的

30、单链与固定在尼龙膜上的寡核苷酸序列杂交，根据杂交信号推测待测序列。引物延伸法（PEX）原理：利用引物延伸到突变位点的前一个碱基，然后将延伸产物分成两管，分别与待测样品的基因组DNA退火，然后在两管中分别加入不同标记的碱基，继续进行延伸反应。根据标记物的性质，检测哪一种碱基掺入到了新的延伸产物中，即可判断待测样品是否有突变。 多聚酶链式反应-单链构想多态分析PCR-SSCP是利用不同构象的单链DNA的迁移率不同而设计的。4. 癌症的分子诊断技术美国前副总统汉弗莱Humphrey) 在1967年发现膀胱内有一肿物，病理切 片未发现癌细胞-良性“慢性增生性囊 肿”，未进行手术治疗。九年后，他被诊断为

31、患有“膀胧癌”，两年后死于该病。1994年，研究者用灵敏的PCR技术对上述汉弗莱1967年的病理切片进行了P53抑癌基因检查，发现那时的组织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其P53基因的第227个密码子已经发生了一个核苷酸的突变。就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出来了现代生命科学飞速发展，已经发现了一些较为成熟的治疗癌症的方法。但是，治疗癌症的关键是，在肿瘤尚未形成或还很小的时候就能检测出异常基因的存在，在未出现任何症状之前即检测出肿瘤的发生，这样能够比任何新型药物疗法挽救更多的生命。 此外，在癌症发生时，端粒酶会具有活性，它可以阻止端粒变短，防止细胞衰老和死亡，所以肿瘤细