1、08硕分子生物学复习题雯雯2 08硕分子生物学复习题雯雯2 08 硕分子生物学复习题 一、 名词解释 1、 基因(gene): 是生物体传递遗传信息和表达遗传信息的基本单位。 目前认为它是合成有功能的蛋白质或 RNA 所必需的全部核苷酸序列。 2、 基因组(geneme): 在分子水平上用人工方法提取或制备 DNA, 在体外切割, 与载体连接成重组体, 然后采用一定方法把重组的 DNA 分子导入受体细胞, 使外源 DNA 在受体细胞中进行复制与表达, 按人们的需要表达不同的蛋白产物或定向的创造生物的新性状, 并使之稳定的遗传给子代。 3、 反义 RNA: (antisense DNA) 碱基序
2、列正好与有意义的 mRNA 互补的 RNA, 称为反义RNA, 又叫调节 RNA。 4、 质粒(plasmid): 是细菌细胞内携带的染色体之外的环状 DNA 分子, 是共价闭合的环状 DNA 分子, 可以独立于细菌染色体而进行复制。 5、 单顺反子: (monocistron) 真核基因是有一个结构基因与相关的调控区组成, 其转录生成的 mRNA 只能翻译成一种蛋白质。 6、 外显子: (extron) 真核生物的结构基因是不连续的, 编码序列被非编码序列打断, 在编码序列之间的序列称为内含子, 编码序列称为外显子。 7、 基因家族(gene family): 是指核苷酸序列或编码产物的结构
3、具有一定程度同源性的一组基因。 8、 假基因: (pseudogene)是在多基因家族中, 某些不能表达有功能产物的基因, 用 表达。 9、 基因超家族(gene super family): 是指一组由多基因家族及单基因组成的更大的基因家族。 它们的结构有程度不等的同源性, 因此它们可能都起源于相同的祖先基因, 但是它们的功能并不一定相同, 这一点正是与多基因家族的差别所在。 这些基因在进化上也有亲缘关系, 但亲缘关系较远, 故将其称为基因超家族。 10、 卫星 DNA(satellite DNA): 是一类高度重复序列, DNA 经密度梯度离心后, 不同层面的 DNA 形成了 不同的条带,
4、 根据荧光强度的分析, 可以看到在一条主带以外还有一个或多个小的卫星带。 这些在卫星带中的 DNA 称为卫星DNA。 11、 基因多态性: (polymorphism) 人类个体之间的千差万别, 主要由环境和遗传因素造成。 由遗传因素所造成的多态性称为, 是由相应的基因控制的 。 12、 操纵子(operon): 是指数个功能上相关联的结构基因串联在一起, 构成信息区, 连同其上游的调控区(包括启动子和操纵区) 以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位, 所转录的 RNA 为多顺反子。 13、 顺式作用元件(cis-acting elements): 是指那些与结构基因表达调控有关, 能够被
5、基因调控蛋白所特异性识别和结合的的 DNA 序列。 包括启动子、 上游启动子元件、 增强子、 加尾信号和一些反应元件等。 14、 反式作用因子(trans-acting elements): 真核生物中, 能够与顺式作用元件特异性结合,对基因表达的转录过程有调控作用的蛋白质。 15、 增强子(enhancer): 指远离转录起始点、 决定基因的时间、 空间特异性、 增强启动子转录活性的 DNA 序列。 16、 基因工程 genetic engineering: 将基因进行克隆, 并利用克隆的基因表达制备特定的蛋白质或多肽产物, 或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工
6、程。 17、 载体(vector): 是用来携带目的基因片段进入受体细胞的 DNA。 这种 DNA 进入受体细胞后, 可自主复制, 或插入到基因组中, 随受体细胞的基因组一起复制。 18、 PCR: 聚合酶链反应, 其原理是依据细胞中 DNA 半保留复制机理, DNA 在不同温度下变性、 复性的特性, 人为控制温度高温变性、 低温复性、 适温延伸, 循环多次后, 可使目的基因得到扩增。 19、 分子杂交: 互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链分子 DNA 分子的过程称为杂交。 20、 基因诊断(gene diagnosis): 以 DNA 或 RNA 为诊断材料, 通过检查基因的存在
7、、 缺陷或表达异常, 对个体状态或疾病作出诊断的方法和过程。 21、 基因治疗(gene therapy): 广义上讲即是应用基因或基因产物治疗疾病的一种方法, 狭义上讲是把外界的正常或治疗基因, 通过载体转移到人体的靶细胞, 进行基因修饰和表达, 改善疾病的一种治疗手段。 22、 RNAi: 即 RNA 干扰,在进化过程中高度保守的、 由双链 RNA 诱发的、 同源 mRNA 高效特异性降解的现象。 23、 启动子(promoter): 是指 DNA 分子上被 RNA 聚合酶识别并结合, 形成起始转录复合物的区域。 24、 蛋白质组学(proteomics): 是指从整体角度分析细胞内动态变
8、化的蛋白质组成成分、 表达水平与修饰状态,进而了 解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域。 25、 探针(probe): 具有放射性或非放射性标记的寡核苷酸, 用于从大量核酸样品中找出互补的目标序列, 然后用放射自显影或其他显色法(如连接的酶作用于可显色底物)显示目标序列所在位置。 26、 剪接体(spliceosome): 剪接体是在进行 RNA 剪接时形成的多组分复合物, 其大小为60S, 主要是由小分子的核 RNA 和蛋白质组成。 剪接体本身需要一些小核 RNA 参与。 这些小核 RNA 不会翻译出任何蛋白, 但对于调控遗传活动起到重要作用。 2
9、7、 miRNA: 一类进化上保守的非编码小分子 RNA, 具有在翻译水平调控基因表达的功能。 1、 病毒、 真核和原核生物的基因组结构特点 (一)病毒基因组结构特点: 1、 病毒基因组所含核酸类型不同: 可以由 DNA 也可以由 RNA 组成。 基因可以是单链、双链; 闭合环状分子或线性分子。 2、 不同病毒基因组大小相差较大; 3、 病毒基因组可以是连续的也可以是不连续的; 4、 病毒基因组的编码序列大: 病毒基因组核酸 95%以上用来编码蛋白质; 间隔区和或调控序列只占 5%以下。 5、 基因可以是连续的也可以是间断的: 病毒基因结构特征往往是和其宿主细胞的基因结构类似。 6、 病毒基因
10、组都是单倍体和单拷贝; 7、 基因重叠: 即同一段核酸序列能够编码 2 种或 2 种以上蛋白质。 8、 病毒基因组功能单位或转录单位: 病毒基因组核酸序列中功能上相关的蛋白质基因往往聚集在基因组的一个或几个特定部位, 形成一个功能单位或转录单元。 9、 病毒基因组含有不规则结构基因: a) 几个结构基因的编码区无间隔 b) 结构基因本身没有翻译起始序列 c) mRNA 没有 5 端帽结构 (二) 原核生物基因组结构特点: 1、 细菌等原核生物的基因组是一条双链闭环的 DNA 分子。 DNA 分子形成超螺旋, 再进一步扭结成花瓣状结构。 细菌 DNA 没有核膜包裹, 为类核。 2、 具有操纵子结
11、构。 3、 基因组中只有 1 个复制起点。 4、 结构基因无重叠现象, 基因组中的任何一段 DNA 顺序不会用于编码两种蛋白质。 5、 基因序列是连续的, 无内含子。 6、 编码区在基因组中所占的比例(约占 50) 远远大于真核基因组, 但又远远小于病毒基因组。 非编码区主要是一些调控序列。 7、 基因组中重复序列很少。 编码蛋白质的结构基因多为单拷贝, 但编码 rRNA 的基因往往是多拷贝的。 8、 具有编码同工酶的基因。 9、 细菌基因组中存在着可移动的 DNA 序列, 包括插入序列和转座子 10、 在 DNA 分子中具有多种功能识别区: Ori、 Tet、 启动子、 终止子等。 (三)
12、真核生物基因组的结构特点: 1.有一定的染色体数目, 配子为单倍体, 体细胞一般为双倍体。 2.基因组大于原核基因组, 结构复杂, 基因数多, 有多个复制起始点, 每个复制子大小不一。 3.为单基因结构, 转录产物为单顺反子。 4.含有大量重复序列 5.断裂基因(split gene) 在真核类结构基因组中, 编码顺序被许多称为内含子的非编码区分割成几段称之。 即由外显子和内含子相间排列组成的具有镶嵌结构的基因。 6.非编码序列90%。 7.功能相关的基因构成各种基因家族。 8.存在可移动的遗传因素。 2、 人类基因组的组织结构特征 人类基因组的重复顺序: 反向重复顺序: 是指两个顺序相同的拷
13、贝在 DNA 链上呈反向排列。 有两种形式, 一 是两个反向排列的拷贝之间隔着一段间隔顺序; 一是两个拷贝反向串联在一起, 中间 没有间隔顺序, 亦称为回文结构。 串联重复顺序: 编码区串联重复顺序; 非编码区串联重复顺序: 通常存在于间隔 DNA 和内含子内。 此类重复顺序是组成卫星 DNA 的基 础。 卫星 DNA 可分为以下三类: 大卫星 DNA, 小卫星 DNA, 微卫星 DNA。 散在重复顺序: 除反向重复顺序和串联重复顺序以外的所有重复顺序。 根据其长度主 要可分为: 短散在核元件(SINEs)、 长散在核元件(LINEs)。 人类基因组 DNA 多态性: 基因多态性: 是由于等位
14、基因间在特定位点上 DNA 序列存在差异造成的。 限制性片段长度多态性: 是指突变、 重排、 单个核苷酸的插入或缺失可是 DNA 顺序 发生改变, 其中有些可能造成限制酶切位点的增加、 缺失或易位, 致使 DNA 分子的 限制酶切位点数目、 位置发生改变。 用限制酶切割不同个体基因组时, 所产生的限制 性片段的数目和每个片段的长度不同。 此即为限制性片段长度多态性。 串联重复顺序多态性: 以相同的核心序列按首尾相连的形式串联排列在一起形成一段特殊的序列。 小卫星 DNA 的多态性 微卫星 DNA 的多态性 单核苷酸多态性: 是指基因组内特定核苷酸位置上存在不同的碱基, 其中最少的一种 在群体中
15、的频率不低于 1%。 3、 原核生物的基因表达调控机制 原核生物基因表达的调控主要在转录水平, 其次是翻译水平。 通常有两种方式: (1) 起始调控, 即启动子调控; (2) 终止调控, 即衰减子调控。 (1) 转录起始的调控 因子控制特定基因的表达, 不同的 因子可以竞争结合 RNA 聚合酶, RNA 聚合酶的核心酶与不同 因子组成的全酶识别不同基因的启动子。 乳糖操纵子是原核生物基因转录负调控的最典型模式。 乳糖操纵子的转录调控机制: 通过负调控因子和正调控因子所进行的复合调控。 阻遏蛋白与操纵基因结合, 防碍 RNApol 与 P 结合形成开放性启动子复合物, 阻止基因转录; CAP 与
16、 CAP结合位点结合促进 RNApol 与 P 结合, 引起有效转录。 乳糖操纵子结构基因转录需具备两个条件: 阻遏蛋白与操纵基因解离 CAP 与 CAP 结合位点结合。 (2) 转录终止的调控 原核生物的转录终止调控方式分两大类: 依赖 因子的终止调控和不依赖 因子的终止调控。 此外, 核糖体也参与转录终止。 例: 色氨酸操纵子表达的调控有两种方式: 通过阻遏蛋白的负调控和通过衰减子作用。 (3) 翻译水平的调控 a) SD 序列的顺序及位置对翻译的影响 SD 序列是位于 mRNA 起始密码子 AUG 上游由 3-9 碱基组成的一段核苷酸序列, 它是核糖体结合的位点。 SD 序列的核心序列是
17、六个嘌呤(AGGAGG), 不同的 SD 序列有一定的差异, 因而翻译起始效率不一样。 SD 序列与起始密码子之间的距离, 也影响 mRNA 翻译效率。 b) mRNA 二级结构隐藏 SD 序列的作用: 在某些 mRNA 分子中,核糖体结合位点在二级结构(茎环) 中, 使核糖体无法结合, 只能打破茎环结构, 核糖体才能结合。 4、 真核生物基因表达的调控机制 真核生物基因表达的调控可以发生 DNA 水平、 转录水平、 转录后水平、 翻译水平和翻译后水平。 DNA 水平的调控: 1、 DNA 的甲基化修饰 DNA 甲基化抑制基因转录的机制: 干扰转录因子对 DNA 元件的识别和结合; 将转录因子
18、的 DNA 识别序列转变为阻抑物的识别序列; DNA 甲基化有利于招募染色质重塑或修饰因子。 2、 组蛋白对基因表达的抑制作用 组蛋白与 DNA 结合, 可保护 DNA 免受保护, 维持基因组稳定性, 抑制基因表达。 去除组蛋白则基因转录活性增高。 3、染色质结构对基因表达的调控作用 真核生物的染色质或染色体是由 DNA 与组蛋白、非组蛋白和少量 RNA 及其它物质结合而形成, 具有核小体结构。 组蛋白 N 末端丝氨酸磷酸化, 使其带正电荷减少, 与 DNA 结合能力降低, 组蛋白中丝氨酸和精氨酸的乙酰化, 同样使组蛋白带正电荷减少, 与 DNA 结合力减弱, 从而有利于转录。 4. 基因重排
19、 某些基因片段改变原来存在顺序, 通过调整有关基因片段的衔接顺序, 再重排成为一个完整的转录单位。 5. 染色质的丢失 6. 基因扩增 细胞在发育分化或环境改变时, 对某种基因产物的需求量剧增, 而单纯靠调节其表达活性不足以满足需要, 只有增加这种基因的拷贝数来满足需要。 转录水平的调控: 转录水平的调控是真核生物基因表达调控中最重要环节。 调控作用主要是通过反式作用因子、 顺式作用元件和 RNA 聚合酶的相互作用来完成的。 反式作用因子通过结合顺式作用元件影响转录起始复合物的形成。 反式作用因子的作用方式: (1) 成环(looping) 反式作用因子结合于增强子后, 利用 DNA 的柔曲性
20、, 弯曲成环, 与 RNA 聚合酶结合位点靠近而发挥作用。 (2) 扭曲(twisting) 使 DNA 构型改变而发挥作用。 (3) 滑动(sliding) 反式作用因子结合到特异的位点上, 然后沿 DNA 滑动到另一特异的序列发挥作用。 (4) Oozing 一种反式作用因子与顺式作用元件结合, 促进另一种反式作用因子与邻近的顺式作用元件结合, 后者又促进下一个反式作用因子与其顺式作用元件的结合, 直到基因的转录起始点, 进而影响基因的转录。 转录后水平的调控: 加帽和 polyA 尾能保证 mRNA 在转录过程中不被降解 mRNA 的选择剪接对基因表达的调控作用(1) Bax 基因转录产
21、物的选择剪接 Bax 基因的编码产物是与细胞凋亡有关的分子, Bax 基因编码产生的蛋白质有几种( 、 、 等),结构略有差异, 差异的产生来自于 mRNA 的选择剪接。 (2) 选择剪接产生的 I B NF- B 是一种广泛存在的反式作用因子, 可与很多基因的上游启动子元件或增强子内部的 B元件结合而调节基因的表达。 翻译水平的调控: (一) 翻译起始的调控 1 阻遏蛋白的调控作用一些特定的翻译抑制蛋白可以结合到一些 mRNA 的 5端, 抑制翻译。 如铁蛋白 mRNA 分子的 5端非编码区有一段约 30 个核苷酸的序列, 称为铁反应元件, 可折叠成一个茎-环结构(即发夹结构)。 铁反应元件
22、可以结合一个铁结合调节蛋白, 抑制 mRNA 的翻译。 2 翻译起始因子的功能调控 eIF-2 是蛋白质合成过程中重要的起始因子, 有些物质可以影响 eIF-2 的活性, 调节蛋白质合成的速度。 4 mRNA 5端非编码区长度对翻译的影响 起始密码 AUG 上游非编码区的长度可以影响翻译水平。 (二) 小分子 RNA 对翻译水平的影响 lin-14 蛋白质是一种核蛋白, 它调控生长发育的时间选择。 lin-4 RNA 结合 lin-14 mRNA 3 UTR 中的特异顺序, 如去掉这种顺序, mRNA 就不会被阻抑。 翻译后水平的调控: 1 新生肽链的水解 是基因表达调控的一个重要环节。 由于
23、合成的蛋白质运输到核及各种细胞器的速度也是受到控制的, 未能及时运输的蛋白质就被迅速降解, 这是控制功能蛋白数量的一种重要机制。 2 肽链中氨基酸的共价修饰 如: 可逆的磷酸化, 甲基化, 酰基化对调节蛋白质活性很重要。 3 通过信号肽分拣, 运输, 定位 5、 在原核生物中如何实现真核基因克隆 基因克隆即是在体外通过人工剪、 接, 将不同来源的 DNA 分子组成一个重组体, 然后插入宿主细胞进行扩增或表达, 通常包含以下几个步骤: a、 目的基因的提取: 供体生物基因或称外源基因的提取 b、 限制性酶切: 目的基因切成不同大小的片段 c、 酶接: 连接到另一 DNA 分子上(克隆载体) d、
24、 转化: 将这个重组 DNA 分子转入受体细胞 e、 筛选和鉴定: 对吸收了重组 DNA 的受体细胞进行筛选和鉴定 f、 基因表达: 对含有重组 DNA 的细胞进行大量培养, 检测外源基因是否表达 6、 在原核生物中如何获得蛋白质类的的基因工程产品(P132, 18) (1) 寻找合适的原核表达载体和获得目的基因; (2) 选择合适的限制性酶分别切割载体和靶基因片段; (3) 用连接酶进行连接反应; (4) 转化: 将重组 DNA 分子转入受体细胞; (5) 筛选 (6) 表达; (7) 从分子量、 生物学活性等方面对表达产物进行初步鉴定; (8) 表达产物的分离纯化。 7、 PCR 的原理和
25、引物设计原则 原理: 依据细胞中 DNA 半保留复制机理, DNA 在不同温度下变性、 复性的特性, 人为控制温度高温变性、 低温复性、 适温延伸, 循环多次后, 可使目的基因得到扩增。 以待扩增的 DNA 分子为模板, 以一对分别于模板 5 末端和 3 末端互补配对的寡核苷酸片段为引物, 在 DNA 聚合酶的作用下, 按照半保留复制的机制沿着模板链延伸至完成新的DNA 合成, 重复这一过程(变性、 退火、 延伸), 即可使目的 DNA 片段得到扩增。 引物设计原则: (1) 长度一般为 1530 个核苷酸; (2) 碱基尽可能随机分布; 避免出现嘌呤, 嘧啶的堆积现象。 GC 含量 40%-
26、55%。 Tm 不低于 54 摄氏度。 (3) 引物自身内部不存在互补序列以避免折叠成发夹结构; (4) 两个引物之间不存在互补序列; (5) 引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性; (6) 引物 3端碱基要与模板 DNA 配对; 最佳是 G 和 C, 因为他们形成的碱基配对较稳定。 (7) 引物与模板结合时, 引物的 5端最多可以游离十几个碱基而不影响 PCR 反应的进行。 8、 核酸分子杂交的的基本过程 具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适当的温度、 离子强度等), 按碱基互补的原则, 重新形成双链 DNA 的过程。 杂交的双方是已知序列和待测序列, 其中已知序列称为探针。 以
27、Southern Blotting 为例, 包括以下步骤: (1) 待测核酸样品的制备。 包括制备待测 DNA 和 DNA 的限制酶消化。 (2) 待测 DNA 样品的电泳分离。 (3) 凝胶中核酸的变性。 (4) Southern 转膜。 常用的转膜方法: 毛细管虹吸印迹法、 电转印法、 真空转移法。 (5) 探针的制备 (6) Southern 杂交。 必须先进行预杂交。 (7) 杂交结果的检测 ) 放射性核素探针的检测: 放射自显影 ) 非放射性核素探针的检测: 地高辛标记探针的检测、 生物素标记探针的检测 9、 基因治疗的基本策略 1. 基因矫正: 将致病基因的异常碱基进行纠正, 而正
28、常部分予以保留。 2. 基因置换: 所谓基因置换是指将特定的目的基因导入特定的细胞, 通过定位重组, 以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。 3. 基因添加: 不除去异常基因, 向靶细胞导入外源基因通过非定点整合, 使其表达产物,从而弥补缺陷基因的功能; 1、 针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基因, 补偿缺陷基因的功能。 2、 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因, 利用其表达产物达到治疗疾病的目的。 4. 基因干预: 采用特定的方法, 抑制某个基因的表达, 或通过破坏某个基因, 使之不能表达, 达到治疗疾病的目的。 10、 基因诊断的常用技术及方法原理 基因诊断中常用的分子生物学技术
29、 (一) 核酸分子杂交 (二) 聚合酶链式反应(PCR) (三) 单链构象多态性检测 (四) 限制酶酶谱分析 (五) DNA 序列测定 (六) DNA 芯片技术 基本原理: 是检测 DNA 或 RNA 的结构变化与否, 量的多少及表达功能是否正常, 以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化, 以此作为疾病确诊的依据。 11、 RNA 如何调节基因表达 RNA 分子在生物大分子加工和基因表达调控等方面还起着重要的作用: 例 1. 反义 RNA 参与 CAP 蛋白的合成调节。 ticRNA 是大肠杆菌中 CAP 蛋白 mRNA 的反义 RNA。 当 CAP 蛋白合成达一定量后, 即可与 cAMP
30、结合成 cAMP-CAP 复合物, 该复合物激活 ticRNA 的启动子转录出 ticRNA, ticRNA 通过与 CAPmRNA 的部分互补形成局部RNA 杂交双链, 从而抑制 CAP 的 mRNA 合成。 例 2. RNAi 作用机制 如 PTGS 特异性通路: 外来基因进入宿主细胞后, 产生 dsRNA, 随后被 dsRNA 特异性核酸内切酶 Dicer 切割成 2123nt 的短片段和 2425nt 的长片段 RNA(siRNA), 当 siRNA 浓度达到阈值后, 以 siRNAProtein Complex 的形式进一步与一系列特异性蛋白质整合, 最重形成沉默复合体 RISC。
31、RISC 利用解旋酶解开 siRNA 双链, 置换掉 mRNA 的正义链, 并使反义链与其互补的靶 mRNA 结合, 再利用 RISC 中的核酸内切酶降解 mRNA, 降解后的mRNA 迅速被细胞内其他 RNA 酶进一步水解, 达到是同源基因表达沉默的效果。 例 3 miRNA 在哺乳动物中, 先转录成一个长的内源性转录本, 然后切割生成 miRNA 前体,当 miRNA 前体从核内转移到胞浆中时, 经 Dicer 酶切割为 stRNA, 他们结合于 mRNA3,端非翻译区, 阻止核糖体与 mRNA 有效结合, 抑制基因表达。 12、 蛋白质组的研究策略 1) 竭泽法: 采用高通量的蛋白组研究技术分析生物体内尽可能多的乃至接近所有的蛋白质人类蛋白组计划。 (双向凝胶电泳、 质谱技术、 生物信息学技术) 2) 功能法: 研究不同时期、 不同环境、 不同部位等的蛋白质组成变化, 以发现有差异的蛋白质为主要目标比较蛋白组学。 3) 功能蛋白质组学: 功能蛋白质组是细胞在一定阶段或某一生理现象相关的蛋白质。
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