博士后研究工作报告.docx

1、博士后研究工作报告封面典范分类号 _ 密级 _UDC _ 编号 _中国科学院生物物理研究所博士后研究工作报告肿瘤克制有关蛋白 RBBP1各构造域的构造与功能研究宫维斌工作达成日期2009年 10月 2011 年 11月报告提交日期2011年11 月中国科学院生物物理研究所（北京）2011 年 11 月题名页典范肿瘤克制有关蛋白 RBBP1 各构造域的构造与功能研究Structural and functional studies of the domains of a tumorsuppression relative protein, RBBP1博士后姓名 宫维斌流动站（一级学科）名称 生物

2、学专业（二级学科） 名称 生物物理研究工作开端时间2009年 10月 28日研究工作期满时间2011年 11月 10日中国科学院生物物理研究所2011 年 11 月中文纲要典范内容纲要RBBP1 蛋白与 RB 家族蛋白特异性互相作用，克制细胞增殖有关基因的转录和表达。别的， RBBP1 与其同源蛋白 RBBP1L1 也参加表观遗传学调控，并克制乳腺癌、白血病等疾病。所以，对 RBBP1 的研究拥有重要的生物学意义和潜伏的医药应用远景。本文对 RBBP1 进行了一系列的构造和功能的研究。RBBP1 蛋白包括 TD 、PD（构造已获得分析）、AD 、CD 和 R2D 等 5 个结构域，。本文经过分

3、子生物学方法和核磁共振方法发现： R2D 构造域不行溶；AD 构造域可溶不稳固； TD、PD 和 CD 构造域能够获得较高浓度的蛋白样品，而且它们皆能够独立折叠，相互之间没有互相作用。TD，PD 和 CD 构造域都属于“ royal family ”家族，该家族主要联合赖氨酸和精氨酸甲基化的组蛋白。本文发现， RBBP1 TD 和 PD 构造域不联合Lys-me1, Lys-me2, Lys-me3 以及 Arg-me2 也不辨别 H3K9me3, H3K27me3,H3K36me3 和 H4K20me3 等甲基化组蛋白。而 CD 构造域联合上述各底物，并且对 H4K20me3 拥有最强亲和力

4、。 所以，CD 构造域是 RBBP1 辨别甲基化组蛋白的重点构造域。我们进一步分析了 CD 构造域的构造，并经过点突变研究确认了其活性位点残基。 CD 构造域拥有典型的 chromobarrel 构造，并形成了该构造域中守旧的芳环盒子，可辨别甲基化组蛋白。我们也分析了 TD 构造域的构造，发现这是一个少见的交错双 Tudor 构造，与组蛋白去甲基化酶 JMJD2A 的双 Tudor 构造近似，而它们的序列同源性低，且拥有不一样的功能。重点词：肿瘤克制有关蛋白，蛋白质构造，核磁共振，蛋白质 -蛋白质互相作用，甲基化组蛋白英文纲要典范AbstractRBBP1 specifically inter

5、acts with RB protein family, suppressing transcription and expression of cell-growing related genes. Moreover, RBBP1 and its homology protein RBBP1L1 also attend epigenetic regulation and function as leukemia and tumor suppressor. Since they are biologically important, we performed a series of struc

6、tural and functional studies with RBBP1, which will help future medical studies.RBBP1 protein has 5 domains, including TD, PD (structure resolved), AD, CD and R2D. In this study, we found that R2D domain is insoluble and AD domain is solublebut not stable. The TD, PD and CD domains are soluble and s

7、table at high concentration. These three domains can fold independently without any interaction with each other.TD, PD and CD domains all belong to the Royal Family, which may bind methylated histone tails on Lys and Arg residues. We found that both TD and PD domains lack ability to bind methylated

8、Lys-me1, Lys-me2, M3L, Arg-me2, and tri-methylated histone tails (H3K9me3, H3K27me3, H3K36me3, and H4K20me3), while CD domain binds all substrates above, with strongest binding affinity for H4K20me3. These results demonstrate that CD domain of RBBP1 is responsible for recognizing methylated histone

9、tails in chromatin remodeling and epigenetic regulation. We further solved the solution structure of CD domain, and confirm its active site by mutagenesis study. CD domain has a typical chromobarrel structure, and has the aromatic cage conserved in the chromobarrel domains, which can recognize the m

10、ethylated histones.We also determined the solution structure of RBBP1 TD domain, which supprisingly represents an interdigitated double Tudor domain similar to JMJD2A, a Jmjc domaincontaining histone demethylase, although they only share very low sequence homology and have different functions.英文纲要典范

11、Keywords: RBBP1, protein structure, nuclear magnetic resonance, protein-proteininteraction, methylated histone英文纲要典范目录典范第 1 章 绪论 11.1 RBBP1 的生物学功能 11.2 RBBP1 的序列剖析与构造域构成 31.3 Royal family 10组蛋白修饰与组蛋白密码 11研究的主要内容和意义 13第 2章 RBBP1 各构造域的表达纯化和功能研究 15资料与方法 152.1.1 RBBP1 各构造域的克隆 152.1.2 RBBP1 TD、PD 和 CD构造域

12、的表达与纯化 162.1.2 核磁样品 182.1.3 RBBP1 TD，PD 和 CD构造域的互相作用研究 182.1.4 RBBP1 TD，PD 和 CD构造域与甲基化氨基酸和组蛋白短肽的互相作用研究 182.1.5 RBBP1 CD 的核磁共振实验与数据剖析192.1.6 RBBP1 CD 的构造分析 20结果 20克隆与表达20互相作用研究222.2.3 RBBP1 CD 的化学位移指认与三维构造262.2.4 RBBP1 CD 的溶液构造剖析以及与甲基化组蛋白尾巴联合的构造基础302.2.5 RBBP1 CD 的突变体研究 32议论 35第 3章 RBBP1 TD 构造域的构造分析

13、37资料与方法 37表达纯化 37核磁样品 37核磁共振实验与数据剖析与构造计算37目录典范3.2 结果 373.2.1 指认与剖析 373.2.2 构造质量 383.2.3 构造描绘与剖析 403.3 议论 40 第四章 结论和展望 44 4.1 主要结论 444.2 工作展望 45 道谢 46 参照文件 47 附录 组蛋白 N 端尾巴的修饰位点 51 博士生时期发布的学术论文 52 博士后时期发布的学术论文 53 个人简历 53 永远通信地点 54目录典范附录典范缩写表ADARID domainARID 构造域ASAngelman syndromes安吉尔曼综合症BMRBBioMagRes

14、Bank生物磁共振数据库CDchromobarrel domain染色质联合桶状构造域COSYcorrelated spectroscopy有关谱CSPchemical shift perturbation化学位移扰动DTTdithiothreitol二硫苏糖醇FPLCfast protein liquid chromatography迅速蛋白质液相层析HDAChistone deacetylase组蛋白去乙酰化酶HSQCheteronuclear single quantum coherence异核单量子有关NMRnuclear magnetic resonance核磁共振NOEnuclea

15、r Overhauser effect核 Overhauser效应NOESYNOE spectroscopyNOE 谱ODoptical density光密度PDPWWP domainPWWP 构造域PWSPrader-Willi普拉德威利综合症RBBP1Retinoblastoma-binding protein 1眼癌蛋白联合蛋白 1RBBP1L1RBBP1-like protein 1RBBP1 近似蛋白 1RBRetinoblastoma protein眼癌蛋白PDBProtein Data Bank蛋白质（构造）数据库RMSDroot-mean-square deviation均方根误差SDSsodium dodecyl sulfate十二烷基硫酸钠SDS-PAGESDS polyacrylamide gel electrophoresisSDS 聚丙烯酰氨凝胶电泳TDTudor domainTudor 构造域TOCSYtotal correlated spectroscopy全有关谱