食品中多种糖醇类甜味剂的测定气相色谱法编制说明.docx

1、食品中多种糖醇类甜味剂的测定气相色谱法编制说明食品中多种糖醇类甜味剂的测定-气相色谱法编制说明一、任务来源本检验方法标准的制定工作，是按照国家认证认可监督管理委员会下达的任务而进行的，项目编号为2009B559，项目名称为食品中多种糖醇类甜味剂的测定-气相色谱法，适用范围为口香糖、糖果、饼干、面包、饮料（包括含乳饮料）等无糖食品中赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇和麦芽糖醇含量的气相色谱法测定。由甘肃出入境检验检疫局负责起草工作。二、本标准制定的背景和意义国际知名学术期刊新英格兰医学杂志2010年发表了一篇中华医学会糖尿病学分会专家撰写的论文，指出中国现有9240万成人患有糖尿病，居全球第一

2、，这意味着中国20岁以上成人糖尿病的患病率达%。此外还有亿人处于糖尿病前期，属高危人群，比例达%1。高达9240万的患者人数超过了国际糖尿病联盟对中国的估计，同时也反映了中国糖尿病患者的数量迅速增加这一事实。对于以上这类人群，合格的无糖食品无疑是他们健康的重要保证。无糖食品是指不含蔗糖（甘蔗糖和甜菜糖）和淀粉糖（葡萄糖、麦芽糖、果糖），而必须含有作为食糖替代品的糖醇（包括木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、甘露糖醇等）的一类食品。糖醇是一类糖的加氢还原产物2，是一种低热、难以消化、甜度较低、吸湿性较大的新型功能型甜味剂。糖醇的代谢途径与胰岛素无关，人体摄入不会引起血糖及胰岛素水平波动，是糖尿病人理想的

3、甜味剂，长期摄入不会引起龋齿，部分糖醇具有膳食纤维功能，可预防便秘、结肠癌等，其缺点是摄取过量会引起腹泻或肠胃不适3。鉴于无糖食品中的糖醇对肥胖和龋齿的保健作用3，我国的龋齿患者、肥胖症患者以及关注健康美丽的减肥瘦身群体也成为无糖食品的主要消费人群。在美国对于无糖、无添加糖或低热等食品的标注有十分细致和严格的规定，其中无糖食品的含糖量必须小于0.5g/日常参考量4。我国无糖食品的检测已经有国家标准GB/T 22222-2008 食品中木糖醇、山梨醇、麦芽糖醇的测定 高效液相色谱法，但是该标准仅规定了食品中的三种糖醇的液相色谱测定方法，检测的目标糖醇涉及面较窄，也未包含气相色谱测定方法。有鉴于此

4、，国家认证认可监督管理委员会下达了食品中多种糖醇类甜味剂的测定-气相色谱法行业标准的制定任务。三、标准编写规则本标准遵循GB/T 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则和GB/标准编写规则 第4部分：化学分析方法规则编写。本标准经八个实验室验证，方法测定低限、添加回收率和精密度均符合要求。四、国内外研究现状1. 食品中常见糖醇的基本信息见下表1。表1 糖醇的基本信息名称CAS编号分子式结构式分子量熔点甜度（相对蔗糖）与血糖关系赤藓糖醇149-32-6C4H10O412211912170%80%很低木糖醇87-99-0C5H12O515293100%低山梨糖醇50-70-4C6H14O6

5、1829610160%70%低甘露糖醇69-65-8C6H14O618216517050%无麦芽糖醇585-88-6C12H24O1134413514075%95%低2. 我国对糖醇类甜味剂的添加规定根据GB2760-2011食品安全国家标准 食品添加剂使用标准规定，山梨糖醇和山梨糖醇液在生湿面制品（如面条、饺子皮、馄饨皮、烧麦皮）中的最大使用量为 g/kg，在冷冻鱼糜制品（包括鱼丸等）中的最大使用量为0.5 g/kg，麦芽糖醇和麦芽糖醇液在冷冻鱼糜制品（包括鱼丸等）中的最大使用量为0.5 g/kg，除以上食品外在该标准的中列入的其他食品中糖醇的最大使用量均“按生产需要适量使用”。目前尚无无糖

6、食品中糖醇最大使用量的相关规定。3. 国内外检测技术现状目前在国内外已报道的糖醇含量的的分析中以研究木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇为主，且多为研究单个糖醇，对于同时测定多种糖醇的方法为数较少。对于赤藓糖醇和麦芽糖醇的检测更是鲜有报道。木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇的检测方法多采用气相色谱法，如：杨天祝等5利用双三甲基硅烷基乙酰胺、三甲基氯硅烷作为硅醚化试剂，通过气相色谱对葡萄糖和甘露醇的稀水溶液进行了定量分析，该方法定量准确，但需要严格控制加入衍生化试剂的量，因此需要操作人员具有丰富的经验。廖桂秀6等使山梨醇和甘露糖醇与乙酸酐在吡啶介质中发生反应，生成乙酸酯衍生物，用无极性的CBP1毛细管柱并采用较慢

7、的程序升温，使得同分异构体山梨糖醇和甘露糖醇衍生物可以较好的得到分离。该方法定量测定了工业山梨糖醇中的甘露糖醇和山梨糖醇的含量，检测体系比较单一，不需进行复杂的样品前处理。王和兴7等用去离子水超声波提取保健食品中的甘露醇，经乙酸酐衍生化后，用SPB-608毛细管色谱柱实现了葡萄糖、肌醇、山梨醇与甘露醇的分离，排除了它们对甘露醇测定的干扰。该方法虽然仅能检测保健食品中甘露醇的含量，但其在精密度和准确度上均达到了食品分析的要求。曹元龙8等研究了食品中木糖醇含量的气相色谱测定法，木糖醇在弱碱性条件下甲基硅烷化衍生，用大口径毛细管柱气相色谱法测定其中木糖醇含量。以正十八烷为内标物，定量测定相对标准偏差

8、 6 % ,方法平均回收率为93. 2 %。虽然该方法可以达到快速准确分析的目的，但由于硅烷化试剂易水解而易导致衍生化反应的失败最终影响测定结果。郑彦婕等9建立了气相色谱质谱同时测定食醋中赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、肌醇、甘露醇、山梨醇的方法。样品经乙腈提取，将葡萄糖肟化，降低了葡萄糖在乙酰化过程缩聚产物产生的基体干扰，6种多元醇经乙酸酐乙酰化后检出限为 mg/L，样品加标回收在93%105%，RSD在2. 8%10. 5%，方法测定的结果准确可靠。胡磊等10介绍了一种用1-甲基咪唑为溶剂和催化剂、盐酸羟胺和乙酸酐为肟化和乙酰化试剂，对植物样品中D-葡萄糖、甘露醇、D-山梨醇和核糖醇进行乙酰

9、化衍生化后的气相色谱分离和质谱鉴定的分析方法，并对糖与糖醇乙酰化影响较大的反应温度、反应时间、反应物组成和反应物浓度等条件进行了比较研究，确定了糖与糖醇乙酰化各步反应的最佳反应温度和反应时间，分析了各组分间相互作用及其用量对衍生化效率的影响。Mark11等利用毛细管气相色谱同时测定植物组织提取液中的有机酸，糖以及糖醇的含量，该研究中由于需要测定有机酸，所以采用了三甲基硅烷化试剂进行衍生，衍生产物对FID检测器的灵敏度比较稳定，因此可以准确的测定有机酸，糖以及糖醇的含量。目前国内外尚未见到同时检测复杂食品基质中赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇的报道，因而建立一种同时测定该5种糖醇含

10、量的快速、有效和准确的分析检测方法，对于准确鉴别市场上的无糖食品质量具有非常重要的实际应用价值。五、主要实验技术论证1. 糖醇衍生方法的选择 气相色谱法具有分析速度快、分离效果好以及灵敏度高等优点。但是糖醇受热时没有足够的挥发性，不能直接用于气相色谱分析，因此在气相色谱分析前需将糖醇制备成易挥发、对热稳定的衍生产物。因此能否准确的测定食品中糖醇的含量，关键取决于选择一种反应完全、操作简单且反应产物单一的衍生化反应，以便于气相色谱的准确检测。常用的衍生方法有三甲基硅烷化(TMS)、甲基化和乙酰化12。TMS化虽然比较常用，但该方法也存在多个缺点：如其衍生化产物分子量大，往往会影响气相色谱的分离效

11、果；三甲基硅烷的空间位阻较大，多羟基化合物衍生化难度大、产物异构体多；TMS化对无水条件要求较高，产物极易水解。甲基化衍生分析特异性低，对于某些物质的分离效果不理想。本实验选择采用乙酸酐将糖醇乙酰化的反应，该衍生化方法具有试剂易得、操作简单等优点，过量的乙酸酐可以控制反应中生成的水，使反应尽可能的向右进行，提高糖醇的乙酰化效率，最终提高分析检测的准确度。乙酰化产物分子量适中，不会导致糖醇乙酰化后分子量过大而影响色谱分离的效果，最终影响对检测结果的判断9,13-18。2. 提取液的选择 赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇均易溶于水，我们采用水作为糖醇的提取液。3. 净化方法的选择对于

12、含少量油脂的样品（如饼干，面包），需先用石油醚对其进行去脂肪处理。对于含少量蛋白质的样品，采用三氯乙酸水溶液作为沉淀剂对其进行去蛋白处理。我们同时对三氯乙酸的浓度进行了考察，实验结果表明：当三氯乙酸浓度为2.5g/L时，可以有效去除样品中的蛋白质，且不会对目标物测定产生影响。4. 衍生 糖醇乙酰化衍生化试剂的选择糖醇常用乙酸或乙酸酐在酸性或碱性的条件下进行乙酰化反应。乙酸酐的酰化能力要强于乙酸，文献中多采用乙酸酐作为乙酰化的反应试剂9,14，因此本实验选用乙酸酐作为乙酰化的反应试剂。糖醇的乙酰化需要在无水条件下进行，文献报道糖及糖醇的溶解多采用吡啶作溶剂，吡啶为有机碱亦可以作为乙酰化反应的催化

13、剂，促进反应的进行。在实验中我们发现，当蔗糖存在条件下，麦芽糖醇的乙酰化反应更彻底，所以当试样中需要测定麦芽糖醇含量时，我们在衍生时加入蔗糖。实验结果表明：加入60 mg蔗糖可以使标准溶液中的麦芽糖醇和待测样品（无蔗糖）中的麦芽糖醇衍生完全。我们认为可能的原因是：由于蔗糖的分子结构与麦芽糖醇相类似，当体系中有蔗糖存在时，蔗糖和麦芽糖醇有协同衍生化反应的作用，可能由于蔗糖和麦芽糖醇分子间的相互作用促进了乙酰化反应的进行或蔗糖的乙酰化产物可能作为麦芽糖醇乙酰化反应的催化剂。为了使无糖样品提取液中的糖醇尽可能转移到反应液中进行反应，本实验加入了N，N-二甲基甲酰胺（DMF）以提高对提取液残渣的溶解程

14、度。衍生反应方程式以山梨糖醇为例，本实验的乙酰化反应方程式如下： 衍生条件的选择 衍生化反应温度 本实验考察了60、70、80、90、100五个温度对反应的影响，结果表明当吡啶：乙酸酐1:1时，反应时间为20min时，反应温度达到90以后，反应完全，反应产物单一，因此本实验最终将反应温度确定为90。衍生化反应时间 本实验在90，吡啶：乙酸酐1:1条件下，分别反应10min、20min、30min、40min、60min，结果表明反应时间达到20min即可使反应达到完全。 吡啶乙酸酐反应比例 本实验在90反应20min, 改变吡啶乙酸酐反应比例为1:4，2:3，1:1，3:2，4:1, 结果表明

15、当二者比例为1:1时，反应最完全。五种糖醇在吡啶：乙酸酐1:1，90反应20min的条件下衍生，气相色谱结果见图1，2。 图1 试剂空白气相色谱图图2 五种糖醇标准品衍生物气相色谱图峰注：1赤藓糖醇；2木糖醇；3甘露糖醇；4山梨糖醇；5麦芽糖醇5. 色谱分离条件的选择为了确定最佳的色谱分离条件，本实验采用了三种不同极性的色谱柱进行了条件实验： 极性色谱柱1：HP-INNOWAX 60m0.25mm（内径）m（膜厚）。色谱条件如下：色谱柱温度：190保持2 min，以每分钟10升温至255保持60min；进样口温度：270；进样体积: 1L；进样方式: 无分流进样；检测器温度：270；载气：%的

16、高纯氮气，流量: mL/min；尾吹气: 45 mL/min；5种糖醇混合标准衍生溶液进样分析，结果见图3.图 3 柱1分离五种糖醇标准品衍生物气相色谱图峰注：1赤藓糖醇；2木糖醇 中极性色谱柱2：VF-17 30m0.25mm（内径） m（膜厚）。色谱条件如下：色谱柱温度：190保持2 min，以每分钟3升温至225，再以每分钟45升温至 330保持3min； 进样口温度：270；进样体积: 1L；进样方式: 无分流进样；检测器温度：270；载气：%的高纯氮气，流量: mL/min；尾吹气: 45 mL/min；5种糖醇混合标准衍生溶液进样分析，结果见图4.图 4 柱2分离五种糖醇标准品衍生

17、物气相色谱图峰注：1赤藓糖醇；2木糖醇；3甘露糖醇；4山梨糖醇；5麦芽糖醇 非极性色谱柱3：OV-101 50m0.25mm（内径）m(膜厚)。色谱条件如下：色谱柱温度：190保持2 min，以每分钟10升温至250保持2min，再以每分钟10升温至 285保持25min；进样口温度：270；进样体积：1L；进样方式：分流进样，分流比50：1；检测器温度：270；载气：%的高纯氮气，流量： mL/min；氢气：45 mL/min，空气：450 mL/min尾吹气：45 mL/min；5种糖醇混合衍生标准溶液进样分析，结果见图5.图 5 柱3分离五种糖醇标准品衍生物气相色谱图峰注：1赤藓糖醇；2

18、木糖醇；3甘露糖醇；4山梨糖醇；5麦芽糖醇从柱1、2、3的分离效果来看，柱1仅能分离出赤藓糖醇和木糖醇；柱2、柱3都能将赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇很好的分离，但麦芽糖醇在柱2上的保留时间重现性较差，见图6，且与麦芽糖的衍生物无法实现有效分离；柱3的分离效果最佳，重现性好，见表2。能很好的将糖醇和常见的糖分离（见图7），所以本实验采用柱3进行检测。图6 在柱2五次分析麦芽糖醇标准品衍生物气相色谱图表2 柱3连续五次进标准品衍生物的相对标准偏差赤藓糖醇木糖醇甘露糖醇山梨糖醇麦芽糖醇Time(min)Area (pA*s）Time(min)Area (pA*s）Time(min)Area

19、(pA*s）Time(min)Area (pA*s）Time(min)Area (pA*s）测得值12345平均值RSD（%）图7 柱3分离糖醇标准和常见糖的衍生物气相色谱图峰注：1赤藓糖醇；2木糖醇；3甘露糖醇；4山梨糖醇；5麦芽糖醇；6+7+8阿拉伯糖；9+10D-甘露糖；10+11葡萄糖；12蔗糖；13+14麦芽糖；15乳糖；16异麦芽糖醇；16+17异麦芽酮糖醇6. 样品量的选择在实验中，我们发现糖类、牛奶、茶饮料样品基质相对简单，而饼干、面包、杏仁露、可乐，橙汁样品基质相对复杂。在样品中糖醇可以被准确测定前提下，适当减少样品量以减小基质的干扰。若糖类样品中糖醇含量大，也可以适当减小称

20、样量。7. 方法测定低限和线性范围方法测定低限的确定在不含本底的样品中添加糖醇法进行实测，测得糖类食品中赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇的测定低限为%，麦芽糖醇为3%；饮料类食品中赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇的测定低限为%，麦芽糖醇为%；饼干面包类样品中赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇的测定低限为%。样品添加测定低限见图8-13。图8 口香糖中赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇的测定低限图峰注：1赤藓糖醇；2木糖醇；3甘露糖醇；4山梨糖醇；5麦芽糖醇图9 奶糖中赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇的测定低限图峰注：1赤藓糖醇；2木糖醇；3甘露糖醇

21、；4山梨糖醇；5麦芽糖醇图10 饼干中赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇的测定低限图 峰注：1赤藓糖醇；2木糖醇；3甘露糖醇；4山梨糖醇；5麦芽糖醇图11 面包中赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇的测定低限图峰注：1赤藓糖醇；2木糖醇；3甘露糖醇；4山梨糖醇；5麦芽糖醇 图12 绿茶中赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇的测定低限图峰注：1赤藓糖醇；2木糖醇；3甘露糖醇；4山梨糖醇；5麦芽糖醇图13 牛奶中赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇的测定低限图峰注：1赤藓糖醇；2木糖醇；3甘露糖醇；4山梨糖醇；5麦芽糖醇线性范围赤藓糖醇衍生物，在 mg/m

22、l浓度范围内，相关系数：=；线性方程y=；标准曲线如图14。 图14 赤藓糖醇衍生物在 mg/ml浓度范围的标准曲线 木糖醇衍生物，在 mg/ml浓度范围内，相关系数：=；线性方程y=；标准曲线如图15。图15 木糖醇衍生物在 mg/ml浓度范围的标准曲线 甘露糖醇衍生物，在 mg/ml浓度范围内，相关系数：=； 线性方程y=；标准曲线如图16。图16 甘露糖醇衍生物在 mg/ml浓度范围的标准曲线 山梨糖醇衍生物，在 mg/ml浓度范围内，相关系数：=； 线性方程y=；标准曲线如图17。图17 山梨糖醇衍生物在 mg/ml浓度范围的标准曲线 麦芽糖醇衍生物，在 mg/ml浓度范围内，相关系数

23、：=； 线性方程y=。标准曲线如图18。图18 麦芽糖醇衍生物在 mg/ml浓度范围的标准曲线8. 典型样品空白及添加糖醇标准品的衍生产物气相色谱图，见图19-30（峰注：1赤藓糖醇；2木糖醇；3甘露糖醇；4山梨糖醇；5麦芽糖醇）图19 饼干空白样品与标准添加衍生色谱图图20 面包空白样品与标准添加衍生色谱图图21 口香糖空白样品与标准添加衍生色谱图图22 奶糖空白样品与标准添加衍生色谱图图23 薄荷糖空白样品与标准添加衍生色谱图图24 牛奶空白样品与标准添加衍生色谱图图25 杏仁露空白样品与标准添加衍生色谱图图26 果粒橙空白样品与标准添加衍生色谱图图27 可乐空白样品与标准添加衍生色谱图图28 绿茶空白样品与标准添加衍生色谱图图29 茉莉蜜茶空白样品与标准添加衍生色谱图图30 鲜橙多空白样品与标准添加衍生色谱图9. 方法的室内回收率和精密度 取本底不含糖醇的饮料（包括含乳饮料）、口香糖、糖果、饼干、面包样品，采用添加法每种糖醇添加三至五个水平，每一水平测定10 次，回收率和精密度实验数据见表3-14。表3 鲜橙多添加回收率和精密度实验数据 表4 果粒橙添加回收率和精密度实验数据表5 茉莉蜜茶添加回收率和精密度实验数据